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豇豆胰蛋白酶抑制剂的大量纯化和急性毒性研究
目的 用大肠杆菌大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白(CpTⅠ)并检测其急性毒性.方法 将重组表达载体pET41-CpTⅠ转化大肠杆菌,用IPTG诱导目的蛋白表达,通过疏水层析和阴离子交换层析等色谱技术纯化大肠杆菌表达的CpTⅠ蛋白.取60只ICR小鼠,随机分成6组,每组10只,雌雄各半,经口灌胃法分别一次性给予10.0、4.64、2.15和1.00g/kg BW的重组CpTⅠ蛋白,并设5.00g/kg的BSA对照蛋白组和水空白对照组,连续观察14d.结果 所有的小鼠在观察期间体重、脏器比重、进食量等均未出现显著变化,在15d大体解剖也未发现明显的病理变化.小鼠对CpTⅠ蛋白的大耐受剂量(MTD)应大于10.0g/kg BW.结论 在该试验条件下,经口灌胃法给予ICR小鼠CpTⅠ蛋白,未发现其毒性.
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脆性X智力低下蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化
目的:在大肠杆菌中对脆性X智力低下蛋白(FMRP)进行重组表达,获得高产量及高纯度的可溶性重组蛋白.方法:以人脑cDNA文库为模板,PCR扩增FMR1基因后将其克隆至融合表达载体pGEX - 6P -1中,重组载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3) pLysS,并用IPTG进行诱导表达.应用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B进行亲和层析纯化GST - FMRP融合蛋白,并以SDS - PAGE电泳和Western blot对融合蛋白的表达进行检测.结果:亲和纯化后的融合蛋白经FMRP及GST单抗分别进行Western blot鉴定为GST - FMRP融合蛋白.结论:大肠杆菌中FMRP ISO10的重组表达产量高,纯化得到可溶性重组蛋白,为FMRP抗体的制备及FXS检测试剂盒的开发奠定基础.
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小鼠可溶性PD-1的克隆、原核表达及活性分析
目的:小鼠可溶性PD-1(sPD-1)原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究.方法:应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆sPD-1基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-sPD-1,转化至E.coliDH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定.将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-sPD-1转化至E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-sPD-1融合蛋白.利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的sPD-1融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性.结果:成功构建重组质粒pGEX-4T-1-sPD-1,并在E.coli BL21(DE3)中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-sPD-1融合蛋白.流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖.结论:成功地克隆、表达和纯化了小鼠sPD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴细胞增殖,为进一步研究其功能和临床应用提供了条件.
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人胎盘叶酸受体蛋白的提取、纯化及鉴定
目的 建立人胎盘叶酸受体蛋白的提取及纯化方法,并对其进行定性定量检测. 方法 采集医院分娩的正常人的胎盘样品.将胎盘剪碎,组织匀浆,酸化及中和,过柱提纯,组分鉴定,除杂并用分子筛进一步纯化.利用Bradford检测蛋白浓度,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染方法进行蛋白分子量检测,用Western Blot对提取蛋白进行定性鉴定. 结果 用于本实验的胎盘湿重370 g.在经过亲和层析柱抽提后的8个留样组分中,组分2～5含有目的蛋白的粗提物.经过分子筛等方法除杂后,Bradford蛋白检测显示本次共提取蛋白总量345 μg.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染方法结果证实此蛋白分子量大约为35 ～40 KDa.Western Blot方法显示此蛋白与叶酸受体抗体特异结合. 结论 使用本研究方法能够从人胎盘中成功提取并纯化人源的叶酸受体蛋白,每100 g胎盘可提取叶酸受体蛋白93 μg.本研究为以后的叶酸受体抗体检测奠定了基础.
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金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的表达、纯化及应用
目的 建立EsxB蛋白的表达、纯化方法,了解金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)感染者血清EsxB抗体阳性比例及其耐药特征.方法 同源重组构建EsxB蛋白原核表达体系,诱导表达后采用超声波法破碎细菌,以镍离子螯合层析柱纯化EsxB蛋白；以EsxB为抗原,应用间接ELISA法检测78例临床金葡菌感染患者血清EsxB抗体；应用全自动细菌鉴定分析仪检测相应的78株金葡菌分离菌株的耐药情况.结果 成功构建EsxB原核表达体系并纯化得到EsxB蛋白；28.2％(22/78)的金葡菌感染患者血清EsxB抗体阳性,来自EsxB抗体阳性患者金葡菌分离株,其多重耐药菌株的比例(100.0％,22/22)和耐甲氧西林菌株的比例(77.3％,17/22)均高于来自EsxB抗体阴性患者的金葡菌分离株[分别为35.7％(20/56)和21.4％(12/56)](P值均＜0.01).结论 建立了 EsxB蛋白的表达、纯化方法；分离自EsxB抗体阳性者的金葡菌均为耐药菌株,且大多数对甲氧西林耐药.
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北柴胡糖基转移酶基因BcUGT3,BcUGT6的表达分析及其原核表达
该研究测定了北柴胡中2个糖基转移酶基因BcUGT3和BcUGT6在不同组织中的转录水平及MeJA处理后不定根中的转录水平.BcUGT3在根、叶、花和果中的转录水平无明显差异,但均高于茎中的转录水平.BcUGT6在叶中转录水平高,在花中低.以未处理的为对照,BcUGT6在MeJA处理后2h,8h,24h,2d,4d的北柴胡不定根中,转录水平均提高近2倍,表明BcUGT6的转录受MeJA影响较小.BcUGT3转录水平随处理时间的延长不断增加,4d时,达7倍左右.利用载体pET-28a(+),进行了2个基因的原核表达.IPTG诱导后,宿主菌表达出了目的蛋白,并获得了纯化蛋白.为后续开展这2个基因的功能研究奠定了基础.
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P[4]、P[6]和P[8]型轮状病毒VP8*核心区蛋白的表达和纯化
为进一步深入研究我国人群中轮状病毒主要流行的P[4]、P[6]和P[8]型毒株的受体结合特点及结构基础,本研究将P[4]、P[6]和P[8]型毒株VP8*核心区(VP8*core)基因分别构建到原核表达载体pGEX4T-1和pET30a中,利用大肠杆菌表达获得轮状病毒P[4]、P[6]和P[8]型毒株VP8*核心区蛋白,并通过亲和层析分别纯化得到VP8* core-GST融合蛋白和VP8*-his标签蛋白,SDS-PAGE显示蛋白大小分别为46 kDa和20 kDa.综上,本研究成功构建了pGEX4T-1-VP8* core和pET30a VP8* core重组质粒,利用原核表达系统得到VP8* core-GST融合蛋白和VP8* core-his蛋白,为VP8*蛋白的功能和结构研究提供基础.
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抗血小板糖蛋白单克隆抗体的纯化及生物活性鉴定
原核表达重组质粒p3MH/P140?Fd,在E.coli XLI-Blue菌中获得了成功表达,利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的"标签"进行亲和层析,对表达产物进行纯化.SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot的检测结果证明,纯化得到的分子量约47kD蛋白是鼠源性的Fab抗体,ELISA检测结果证明,P140Fab抗体与人血小板能特异性结合.体外二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集抑制试验证明,P140Fab抗体对血小板的聚集有抑制作用,并且具有剂量抑制效应,IC50的平均值为16.85mg/L.
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重组人leptin的复性、纯化和免疫学及生物学活性鉴定
对重组人leptin(rh-leptin)蛋白进行复性及纯化,并鉴定其免疫学及生物学活性.将由大肠杆菌(E.coli)重组表达获得的rh-leptin,复性、纯化后进行SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交鉴定其特异性,并通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验检验其生物学活性.结果表明通过对rh-leptin进行复性和纯化,获得了高纯度的具有免疫学和生物学活性的rh-leptin蛋白,可供进一步研究应用.
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人单核细胞趋化蛋白-1在大肠杆菌中的高效表达及其生物学活性
利用PCR和DNA重组技术,将人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)cDNA克隆在表达载体pGEX-2T中,表达产物GST/MCP-1占菌体总蛋白的50%,且以无活性的包涵体形式存在.经变复性,Glutathione Sepharose 4B亲合柱层析纯化,融合蛋白达到电泳纯,且具有MCP-1趋化活性.体内外抗肿瘤试验结果表明,GST/MCP-1激活单核细胞和淋巴细胞后可抑制肿瘤细胞生长,提示MCP-1可能成为肿瘤辅助治疗的一个候选药物.
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截短ALT1蛋白的获得及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达、纯化截短ALT1蛋白,制备ALT1多克隆抗体.方法 利用pCold TF载体原核表达系统,IPTG诱导,表达经生物信息学分析含有两个编码ALT1抗原表位的ALT1 N端1～115个氨基酸序列的基因片段,依次经镍(Ni)离子亲和柱纯化、HRV 3C蛋白酶酶切、二次镍离子亲和柱纯化和分子筛柱层析得到不带标签的截短ALT1纯蛋白,用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.结果 经测序证实,成功构建了截短pCold TFT-ALT1表达载体.获得纯度达90％的不带标签的截短ALT1重组蛋白,制备了效价达4.0×106的ALT1多克隆抗体,经Western blot鉴定,能特异性地识别ALT1抗原和肝细胞裂解液.结论 成功获得高质量的截短ALT1无标签蛋白及其特异的多克隆抗体,为ALT1的免疫学检测试剂的研发提供了依据.
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重组人源galectin-1通过调节自噬水平保护神经元
目的 制备重组人源半乳糖凝集素1(rhgalectin-1),并研究其对受损神经元自噬水平的促进作用.方法 利用PCR技术构建pEGX-4T-1-galectin-1原核生物蛋白表达质粒,构建工程菌.收集rhgalectin-1蛋白,并进行纯化及纯度鉴定.用细胞毒性物质鱼藤酮(rotenone)处理神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系,检测在有无rhgalectin-1预处理的情况下自噬标志物LC3Ⅱ以及p62的水平,分析不同组别细胞的自噬水平.结果 成功制备了具有生物学活性的rhgalectin-1,发现rhgalectin-1可降低鱼藤酮对SK-N-SH细胞的毒性作用.鱼藤酮处理SK-N-SH细胞后,其自噬水平有所降低.表现为LC3Ⅱ水平明显降低以及p62水平明显增加(P<0.05).而rhgalectin-1预处理组细胞自噬水平明显增加,LC3Ⅱ水平明显升高,p62水平明显降低(P<0.05).当用自噬阻断剂bafilomycin阻断自噬体降解后,可观察到rhgalectin-1预处理并给予鱼藤酮刺激组较单独鱼藤酮刺激组LC3Ⅱ水平明显增加(P<0.05),此现象说明了rhgalectin-1处理的确增强了自噬水平而不是抑制自噬体的降解.结论 rhgalectin-1可以增强神经元的自噬水平,这一特性可能在神经元的毒性抵抗以及损伤后修复过程中发挥重要作用.
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大鼠脑组织NT-3融合蛋白的表达、纯化及抗体制备
目的 克隆大鼠脑组织神经营养素3(NT-3)基因,原核诱导表达并纯化,制备高效价抗体,为研究其对周围神经损伤修复的影响提供实验基础. 方法 用RT-PCR法扩增目的 基因,依次克隆入pMD-18T载体及亚克隆入pRSET-A原核表达载体.导入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定后用镍柱纯化.免疫家兔制备特异性抗体. 结果 RT-PCR得到777 bp的片断,酶切鉴定及测序证实与GeneBank中大鼠NT-3序列一致,成功构建了原核表达载体pRSET-A-NT-3.导入BL21诱导得到一条约34 ku的新蛋白带.免疫家兔获得1∶64000的高效价特异性抗大鼠NT-3血清.
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无融合标签人胱抑素C重组蛋白的制备
目的 构建人胱抑素C(CysC)基因的原核表达质粒pCold TF-CysC,表达并制备去标签蛋白的CysC.方法 用人CysC的全长编码基因插入原核表达载体pCold TF并测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导、镍柱纯化后获得带有His标签的重组蛋白TF-CysC.利用GST-HRV 3C蛋白酶去除该融合蛋白的TF标签,再经分子筛一步法同时去除TF标签、3C蛋白酶获得CysC,SDS-PAGE鉴定其纯度.用该CysC免疫新西兰大白兔,制备抗血清,并用间接ELISA及Western blot鉴定.结果 测序结果与Genbank中人CysC序列一致,实现了CysC可溶性高表达.纯化的无标签CysC纯度大于95％,分子质量约为13.3 ku,与预期相符.免疫家兔后,获得的抗血清效价达到1:4×106以上,能特异性识别市售CysC蛋白.该蛋白稳定性良好,在4℃保存一个月未见明显下降.结论 成功应用原核表达系统,获得了可用作免疫诊断试剂标准品的CysC,为进一步建立CysC的免疫检测方法奠定了基础.
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带6个组氨酸尾的可溶性GDNF第1受体的重组表达和活性分析
目的用DNA重组方法去除胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)受体(GFRα-1)基因3'-端的与细胞膜糖基化磷脂酰肌醇(GPI)相连的信号序列,使表达的GFRα-1以可溶性形式介导GDNF的作用.方法设计-对引物,其中下游引物含有6个组氨酸密码子序列,以人GFRα-1全长cDNA为模板,PCR扩增编码可溶性GFRα-1序列并亚克隆于pBK-RSV真核表达载体,转染COS-7细胞,收获培养上清,进行SDS-PAGE及Western免疫印迹分析;使用钴离子金属螯合层析柱进行纯化;检测RET酪氨酸磷酸化以鉴定其生物学活性. 结果Westem免疫印迹证实培养上清液中有分子量为60kD的特异阳性条带,与糖基化的GFRα-1分子量相符;金属螯合层析得到纯度达90%以上的重组GFRα-1蛋白,每ml COS-7培养上清中含有0.5μg. 结论带6个组氨酸尾的重组可溶性GFRα-1能够介导GDNF的作用,可引发酪氨酸激酶RET的磷酸化.
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细胞分选蛋白17多克隆抗体的制备和鉴定及在小鼠体内的表达
目的 制备细胞分选蛋白家族成员细胞分选蛋白17(SNX17)的多克隆抗体,为深入研究SNX17奠定基础.方法 PCR扩增编码人SNX17C端270个氨基酸的(c)DNA片段,DNA重组入原核表达载体pGEX-4T-1和pMal-C2x,转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分别表达GST-SNX17C端和MBP-SNX17C端融合蛋白.采用电泳纯化的GST-SNX17C端融合蛋白于第1天,第28天,第42天3次免疫新西兰白兔.采用亲和层析和分子筛纯化的MBP-SNX17C端融合蛋白,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中多克隆抗体的效价,于第56天取兔全血,析出血清,纯化IgG.免疫印迹法检测SNX17兔多克隆抗体的有效性和特异性,免疫印迹法检测小鼠30种器官中SNX17的表达.结果 成功构建了pGEX-4T-1/SNX17C端和pMal-C2x/SNX17C端的表达质粒,成功诱导表达纯化了GST-SNX17C端和MBP-SNX17C端融合蛋白,纯化后的IgG可识别COS-7细胞中外源转入的GFP-SNX17,并与GFP抗体识别的条带在同一位置上,通过SNX17C端多克隆抗体检测了SNX17在小鼠子宫、卵巢和乳腺中表达高而在睾丸、前列腺和输精管中表达低.结论 成功制备特异而有效的兔抗人SNX17C端多克隆抗体,此抗体可用于免疫印迹法分析,初步确定了SNX17在小鼠器官中的表达谱.
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细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析
目的 对细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶(Eg mMDH )重组质粒进行原核表达、纯化,并初步鉴定重组蛋白的免疫学特性. 方法 对已构建的基因工程菌株mMDH/pGEM-T/JM109进行酶切,获取目的基因.将目的基因重组到pET28a表达载体上,筛选阳性表达菌株并进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组mMDH蛋白质为包涵体后,超声破碎细胞,尿素溶解包涵体,镍柱亲和层析法纯化,获取重组蛋白.以纯化的mMDH作抗原免疫小鼠,用Western blot和ELISA方法检测重组蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平. 结果 成功构建原核重组表达载体mMDH/pET28a/BL21,并纯化出浓度较高的重组蛋白.ELISA结果显示,重组抗原免疫小鼠诱导产生了一定水平的血清抗体;Western blot显示,原头蚴、囊液等天然抗原能被重组抗原免疫的小鼠血清识别. 结论 纯化后的重组蛋白mMDH具有较强的免疫原性,有望作为包虫病候选疫苗,值得进一步深入研究.
关键词： 细粒棘球蚴 线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH) 蛋白纯化 免疫鉴定 -
弓形虫SAG1可溶性融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化
目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫SAG1抗原,为研制新型弓形虫病基因工程诊断试剂盒奠定基础. 方法将重组pGEX-SAG1表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物的表达形式.通过降低培养温度和升高LB培养基的pH,诱导融合蛋白在上清中表达,表达产物以硫酸铵沉淀、GST亲和层析和Sephadex G-150凝胶过滤层析进行纯化.Western blot检测纯化融合蛋白的免疫反应性. 结果 37 ℃条件下,SAG1以融合蛋白(SAG1-GST)的形式在大肠埃希菌中高效表达,表达蛋白以包涵体形式存在.在27 ℃和升高LB培养基pH条件下,融合蛋白在上清中得到表达,经纯化后其SAG1可溶性蛋白纯度可达90%以上.Western blot分析纯化蛋白能被弓形虫感染者血清所识别.结论 SAG1可溶性蛋白在大肠埃希菌中得到了表达,经纯化后能被弓形虫感染者血清所识别,可用于制备弓形虫感染诊断试剂盒.
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弓形虫GRA6基因的重组、表达及鉴定
目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白6(GRA6)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达. 方法 根据弓形虫GRA6基因序列设计并合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA6基因片段,扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定后,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经限制性内切酶BamHI、EcoRI酶切鉴定并测序后,将重组质粒转化大肠埃希菌BL21后并用IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blot分析其反应原性. 结果 以弓形虫DNA为模板扩增GRA6基因片段,经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物大小为693 bp,与理论值相符;重组质粒经酶切鉴定构建成功,测序结果与GenBank上弓形虫RH株GRA6序列AF239283.1同源性100％;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA6融合蛋白分子质量单位约为52 ku,与GST-GRA6的理论分子质量相符,该融合蛋白可被GST标签抗体识别. 结论 成功重组了弓形虫GRA6基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础.
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细粒棘球蚴MKK1和MKK2基因原核表达载体的构建及其诱导表达
目的 分别构建细粒棘球蚴(Eg)丝裂原活化蛋白激酶激酶MKK1和MKK2基因原核表达载体,诱导表达并纯化EgMKK1和EgMKK2蛋白.方法 采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴,Trizol法提取原头蚴总RNA,反转录PCR分别扩增EgMKK1和EgMKK2基因片段,克隆至原核表达载体pET28a(|),经限制性内切酶双酶切和测序鉴定正确后转化大肠埃希菌感受态细胞BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化蛋白,并进行SDS-PAGE分析.结果 测序证明pET28a EgMKK1和pET28a-EgMKK2原核表达载体构建正确,在37 C经IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导可表达EgMKK1和EgMKK2蛋白,分子质量单位分别为44.96 ku和64.01 ku,与理论值相符,且以包涵体形式存在.表达产物纯化后的可溶性蛋白EgMKK1和EgMKK2含量分别为0.64 mg/ml 和 1.2 mg/ml.结论 成功构建了MKK1和MKK2基因原核表达载体,表达蛋白可用于动物免疫,为研究EgMKK1和EgMKK2在Eg体内的生物学作用奠定了基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 MKK1和MKK2基因 基因表达 蛋白纯化
