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人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体.方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITFcDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和a分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF.结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段.结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF.并制备其抗体的进一步研究提供基础.
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人孕酮受体膜组分1表达载体的构建及其重组蛋白对体外血管形成的诱导作用
目的：构建含人孕酮受体膜组分（progesterone receptor membrane component，PGRMC）1的重组表达质粒，转染人卵巢癌细胞，研究其调控卵巢癌细胞血管生成的作用。方法：以卵巢癌细胞为模板，采用PCR技术扩增PGRMC1基因编码序列，插入真核载体pSecTag-2B构建重组表达载体；然后，将重组载体pST-PGRMC1分别转染人胚肾上皮细胞HEK293T和卵巢癌细胞SKOV-3，采用蛋白质印迹法检测PGRMC1蛋白的表达；实时荧光定量PCR检测卵巢癌细胞中VEGF mRNA的变化，用ELISA法检测上清液中VEGF的分泌情况。体外血管生成实验进一步观察PGRMC1促进体外血管生成的情况。结果：重组表达载体pST-PGRMC1构建成功，重组蛋白PGRMC1在HEK293T和SKOV-3细胞中都能够表达；PGRMC1过表达可促使卵巢癌细胞合成 VEGF，并且促进体外血管的形成。结论：重组蛋白PGRMC1在促进卵巢癌细胞体外血管形成中起着重要作用，可能促进卵巢癌细胞的远处转移。
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hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位
目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中.然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位.结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2058bp,并测序成功.Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105kDa.pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周.结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周.
关键词： 人Polo样激酶2 Western blot 绿色荧光蛋白 质粒构建 -
大鼠补体C5a蛋白真核、原核表达载体的构建以及体外表达的鉴定、纯化和生物学活性分析
目的:构建带His标签的大鼠补体C5a蛋白真核表达载体pIRES2-EGFP-C5a和原核表达载体pET-21a-C5a,分别观察其体外表达情况,将C5a蛋白纯化后分析其生物学活性.方法:以RT-PCR方法从大鼠肝细胞中扩增出大鼠补体C5a基因全长cDNA序列,在序列的N端添加6个组氨酸His标签后,插入含增强绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP,用脂质体法转染HEK293细胞,免疫印迹法检测C5a蛋白的表达水平;以真核表达质粒pIRES2-EGFP-C5a为基础,将大鼠补体C5a基因亚克隆至原核表达载体pET-21a,体外检测C5a蛋白的表达情况,之后再行Ni2+螯合亲和层析柱纯化C5a蛋白.以C5a刺激中性粒细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧的生成;C5a刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMC)不同时间,RT-PCR测定其产生IL-6和TNF-α的水平.结果:RT-PCR扩增出了大鼠补体C5a基因;并成功构建了pIRES2-EGFP-C5a重组质粒,体外成功转染入HEK293细胞,并在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,但免疫印迹法未能检出C5a蛋白的表达;另成功构建了pET-21a-C5a原核表达载体,并在体外用免疫印迹法检测到了C5a蛋白表达.另用亲和层析纯化得到了带His标签的C5a蛋白,证实C5a能促进中性粒细胞呼吸氧爆发.结论:成功构建了大鼠补体C5a真核和原核表达载体.构建的原核表达载体可测到C5a蛋白的表达,且C5a蛋白具有相应的生物学活性.
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HNF4α真核表达载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达
目的:构建pcDNA3.1/HNF4α重组质粒,转染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs),并检测其在HUMSCs中的表达.方法:采用基因重组技术构建载体pcDNA3.1/HNF4α,经酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HUMSCs后,进行RT-PCR和Western blot分析,免疫荧光检测转染后1周肝特异性生化指标.结果:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1/HNF4α,转染人脐带间充质干细胞后,RT-PCR示转染后HNF4α mRNA表达,Western blot分析见HNF4cα蛋白表达,免疫荧光示转染1周后HNF4α促进了HUMSCs向肝细胞方向分化.结论:成功构建真核表达载体,并在HUMSCs中正确表达,为进一步研究HNF4α在干细胞向肝细胞分化中作用提供了实验基础.
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铁调节蛋白1真核表达质粒的构建及功能初步研究
目的:构建人来源铁调节蛋白1(IRP1)真核表达质粒,检测该质粒在人肝癌细胞(HepG2)中的表达及其对转铁蛋白受体1(TfR1)和二价金属转运体1(DMT1)表达的影响.方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应获得IRP1的cDNA.根据不同的酶切位点分别构建IRP1 4个分段目的基因,依次连接4段基因并将其构建入真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列.用FuGENEHD将质粒pcDNA3.1 (+)-IRP1瞬时转染至HepG2.以QRT-PCR方法检测转染pcDNA 3.1(+)-IRP1质粒,观察对IRP1以及其调控基因TfR1和DMT1表达的影响.结果:扩增出IRP1全长cDNA,构建真核表达质粒,4个质粒经相应酶双酶切后,分子量分别为1261bp、502bp、600bp、310bp.经检测质粒转染至HepG2细胞后,IRP1表达显著高于转染空载质粒细胞.结果显示与对照组相比,转染真核pcDNA3.1(+)-IRP1质粒后IRP1表达显著上调约50倍,TfR1表达增加约3倍,DMT1表达增加约1.5倍,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建人IRP1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IRP1,并证明其能在HepG2细胞内高表达,从而影响IRP1调控基因的表达.
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人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定
目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)的表达.方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列.用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析.结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确.经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞.结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达.
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NLRP3基因真核表达载体的构建和定位
目的:构建人NLRP3真核表达载体,并证实融合蛋白在人心肌细胞中定位.方法:以人胎脑cDNA文库为模版,PCR扩增NLRP3全长编码基因,亚克隆至p3×FLAG-cmvTM-10表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到人心肌细胞中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测.利用激光共聚焦扫描显微镜观察FLAG-NLRP3在HCM细胞内定位.结果:NLRP3全长基因序列克隆到了真核表达载体p3×FLAG-cmvTM-10中,酶切鉴定片段大小3 111 bp.Western blotting检测到了融合蛋白FLAG-NLRP3表达,分子量约为114 kD.FLAG-NLRP3在人心肌细胞中表达,定位于细胞浆内.结论:成功构建了FLAG-NLRP3全长基因真核表达载体,FLAG-NLRP3蛋白主要定位于心肌细胞浆内.
关键词： 质粒构建 NLRP3 蛋白印迹 激光共聚焦扫描显微镜 -
利用重构pc-MDR1质粒快速诱导肝癌细胞耐药
目的: 从裸鼠原位耐药肿瘤组织中进行MDR1 cDNA的全克隆和pc-MDR1重组质粒的构建,并转染Hep G2细胞,快速诱导其耐药,并筛选其抗性克隆. 方法: 设计单酶切位点引物,利用长距离逆转录PCR(Long RT-PCR)技术,由HepG2耐药细胞扩增 MDR1 cDNA,约3.8 kb大小.将其插入至真核表达载体pcDNA 3.0质粒中构建pc-MDR1诱导质粒,使其能够在真核细胞中表达p-gp蛋白.转染HepG2细胞,并用G418筛选出转染的细胞. 结果: 成功地扩增出3.8 kb左右的MDR1 cDNA片段,经酶切鉴定、RT-PCR扩增特异片段和序列测序结果显示质粒构建初步成功,用G418筛选细胞耐药抗性克隆的时间约为14 d. 结论: 从耐药肿瘤组织中进行MDR1 cDNA的全克隆和pc-MDR1诱导质粒的构建成功快速诱导了肝癌细胞发生耐药,为进一步研究肿瘤细胞的耐药机制奠定了很好的基础.
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细胞周期蛋白C基因克隆与重组质粒pCMV-tag2B-CCNC的构建与鉴定
[目的] 克隆人细胞周期蛋白C基因(human cyclin C,CCNC),构建真核表达载体,诱导并鉴定其表达.[方法] 利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法,以急性淋巴细胞性白血病细胞株6T-CEM mRNA为模板,扩增CCNC基因,将克隆获得的CCNC全长cDNA片段构建重组表达载体pCMV-tag2B-CCNC,用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染至6T-CEM细胞系,诱导其表达,Western Blot鉴定其表达.[结果] 电泳获得944bp预期序列,pCMV-tag2B-CCNC经双酶切鉴定及序列分析证实为正确的有完整读码框的CCNC基因,将pCMV-tag2B-Sorcin导人6T-CEM细胞并成功表达,目的蛋白经Western blot鉴定具有生物学活性.[结论] 经测序及酶切鉴定,成功克隆了CCNC的cDNA,并成功构建了CCNC真核表达质粒pCMV-tag2B-CCNC,重组质粒能表达具有生物学活性的CCNC蛋白,为研究CCNC的功能打下了基础.
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共表达p53、p16基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达
[目的]构建p53、p16基因真核表达载体,观察其在K562细胞中的表达.[方法]设计并构建包含野生型p53cDNA、p16cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-53-16,脂质体法转染K562白血病细胞.用间接免疫细胞化学法、Western blot等方法鉴定外源性p53及p16的表达情况.[结果]构建成功p53、p16基因双表达真核载体,体外成功转染人K562细胞,检测到K562细胞外源性p53、P16蛋白的表达.[结论]重组质粒pBudCE4.1-53-16体外转染K562细胞后,目的基因能够在细胞中同时表达,为进一步研究两种基因用于肿瘤治疗奠定基础.
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血清反应因子全长及N端片段过表达慢病毒载体的构建及其对心脏干细胞分化的影响
目的 探讨血清反应因子全长(SRF-Full)及N端片段(SRF-N,1-254aa)对TGF-β1诱导c-Kit+心脏干细胞(cardiac stemcell,CSC)分化的影响.方法 从cDNA文库扩增大鼠SRF-Full及SRF-N表达序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV358(Ubi-MCS-3 FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin),转化感受态细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定.将SRF-Full及SRF-N过表达质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T,包装慢病毒.磁激活细胞分选法分离乳SD大鼠c-Kit+ CSC,将SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒感染CSC并经TGF-β1诱导,定量PCR分析下游分化基因mRNA水平的变化.结果 成功扩增出SRF-Full及SRF-N编码序列并正确连接入线性化载体,获得的阳性转化子经测序无误.将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后,获得滴度为2×108 TU/mL的慢病毒颗粒,Western blot检测到预期Flag融合蛋白.重组慢病毒感染CSC后细胞核中见eGFP信号.TGF-β1诱导CSC出现心肌细胞分化基因(Nkx2.5、Gata4、cTnI)及平滑肌细胞分化基因(SM22α)的表达,内皮细胞分化(vWF)无影响,SRF-Full促进CSC的心肌细胞分化,而SRF-N则抑制这种分化.结论 成功构建SRF-Full及SRF-N过表达重组慢病毒质粒.SRF-Full促进而SRF-N减弱TGF-β1诱导CSC的心肌细胞分化.
关键词： 血清反应因子 血清反应因子N端片段 质粒构建 心脏干细胞 细胞分化 -
HIF-1α过表达慢病毒载体的构建及对心肌细胞Notch配体Jagged1表达的影响
目的 构建低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)过表达重组慢病毒质粒并包装病毒,将病毒感染乳鼠心肌细胞,分析其对Notch配体Jagged1表达的影响.方法 从cDNA文库中PCR扩增人HIF-1α编码序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV218,转化感受态大肠杆菌细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定.将HIF-1α过表达慢病毒质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T,包装出慢病毒颗粒.原代分离SD乳大鼠心肌细胞,将HIF-1α过表达慢病毒感染心肌细胞,定量PCR分析Jagged1 mRNA水平的变化.结果 成功扩增HIF-1α编码序列并正确连接入线性化载体GV218,获得阳性转化子并测序无误.将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后,获得滴度为1×108 TU/ml的慢病毒颗粒,Westernblot法检测到HIF-1 α-GFP融合蛋白.重组慢病毒感染乳鼠心肌细胞后,胞核中见GFP信号.与对照组相比,HIF-1 α过表达5天后显著上调Jagged1 mRNA的水平.结论 心肌细胞中HIF-1α可诱导Jagged1的表达.HIF-1 α过表达重组慢病毒载体的成功构建,为研究缺血缺氧性心肌损伤反应的分子机制奠定了基础.
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热激启动子驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP的构建与鉴定
目的 构建热激启动子(pHSP)驱动的靶向敲低Polo样蛋白激酶1(PLK1)的真核表达质粒,并观察其对骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响.方法 首先合成热休克蛋白HSP70的启动子,克隆至带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达质粒pEGFP-C1中,利用pHSP替换原有的CMV启动子,构建真核表达载体pHSP-GFP;其次,利用RNA干扰技术合成以plk1基因为靶向目标的shRNA,将其定向克隆至真核表达载体pHSP-GFP中形成重组质粒pHSP-shPLK1-GFP;另外设计一组阴性对照质粒pHSP-NC-GFP,后,利用脂质体Lipo2000转染的方法将质粒转染至U2OS细胞,非热激组细胞正常培养,热激组及阴性对照组细胞42 ℃加热2 h,通过细胞免疫荧光染色实验检测GFP的表达,从而确定pHSP的驱动能力,采用Real-time PCR法检测细胞内plk1的mRNA表达水平,Western blot法检测PLK1蛋白表达水平,MTT法检测重组质粒对U2OS细胞增殖的影响.结果 成功构建了pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP;细胞免疫荧光染色实验结果显示pHSP可正常驱动gfp基因的表达,且GFP蛋白定位在胞质中;Real-time PCR结果显示热激组细胞plk1基因表达量明显降低,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示热激组细胞PLK1蛋白表达量比非热激组及阴性对照组低(P<0.05);MTT结果显示热激组细胞的增殖活性被明显抑制,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP能在U2OS细胞中表达,在42 ℃加热条件下,该重组质粒呈现更强的下调plk1基因表达和抑制增殖作用.
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CLIC1及其点突变体与Sedlin蛋白的共定位研究
目的：构建胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)点突变体的真核表达质粒，进行CLIC1突变体的表达、定位及其与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白( Sedlin)的共定位研究，为进一步揭示其功能奠定基础。方法以CLIC1全长cDNA序列为模板，构建3个真核表达质粒即 pcDNA3．1-CLIC1(C24A)-FLAG、pcDNA3．1-CLIC1(C59A)-FLAG、pcDNA3．1-CLIC1( C24A-C59A)-FLAG；Western blot法检测CLIC1及其点突变体在 HEK 293T 细胞中的表达；免疫荧光技术了解CLIC1及其点突变体蛋白在COS7细胞中的定位及与Sedlin的共定位情况。结果成功构建了CLIC1点突变体的真核表达质粒；Western blot 结果显示3个点突变体蛋白在HEK293T细胞中均能表达，突变体的分子量低于野生型的；免疫荧光实验表明CLIC1蛋白在细胞质和细胞核都有表达，但主要在细胞核。 CLIC1点突变体蛋白定位在胞质中，细胞核中无分布，与 Sedlin 蛋白在胞质存在共定位。结论CLIC1的3种点突变体均能在哺乳动物细胞中有效表达；CLIC1及其点突变体与Sedlin蛋白均存在共定位，提示两种蛋白之间可能存在相互作用。
关键词： CLIC1 质粒构建 免疫荧光 Western blot -
RACK1突变体在哺乳动物细胞中的表达及定位研究
目的：根据活化蛋白激酶C受体1( RACK1)的蛋白结构，构建其缺失突变体的真核表达质粒，研究RACK1缺失突变体在真核细胞内的表达及定位改变。方法根据RACK1蛋白的结构域特点，以 pcDNA3．1-RACK1-FLAG 为模板，构建真核表达质粒pcDNA3．1-RACK1(51-317)-FLAG、pcDNA3．1-RACK1(93-317)-FLAG、pcDNA3．1-RACK1(135-317)-FLAG、pcDNA3．1-RACK1(180-317)-FLAG、pcDNA3．1-RACK1(219-317)-FLAG；Western blot检测上述重组质粒在HEK 293T细胞中的表达；免疫荧光技术检测RACK1的各缺失突变体在COS7细胞中的定位情况。结果成功构建了RACK1各缺失突变体的真核表达质粒；Western blot结果表明，除pcDNA3．1-RACK1(219-317)-FLAG外，其余缺失突变体在 HEK 293T 细胞中均有效表达；免疫荧光实验表明RACK1缺失突变体在COS7细胞中主要定位在胞质，细胞核中也有少量分布。结论成功构建了RACK1缺失突变体真核表达质粒，并在 HEK 293T和 COS7细胞中成功表达；在COS7细胞中不同缺失突变体的表达定位均有差异，与野生型的RACK1相比也有所不同，表明缺失不同的结构域后其在细胞中的定位表达也发生了改变。这为研究RACK1各结构域的功能提供了重要依据。
关键词： 突变体 质粒构建 免疫荧光 Western blot 结构域 -
人EBI3蛋白及其突变体的表达及定位研究
目的：研究人EB病毒诱导的基因3(EBI3)及其突变体在哺乳动物细胞中的表达及定位差异及其原因。方法基于NCBI 数据库中人EBI3氨基酸的序列分析,利用分子克隆技术构建人EBI3真核表达质粒pcDNA3．1-EBI3-FLAG、单独包含氨基端或羧基端Ⅲ型纤连蛋白(FN3)结构域的缺失突变体的表达质粒pcDNA3．1-EBI3(1~135)-FLAG 和 pcDNA3．1-EBI3(125~230)-FLAG 以及第210位天冬氨酸(Asp)点突变体Asp210的表达质粒pcDNA3．1-EBI3-D210AFLAG； Western blot 方法检测EBI3及其突变体在HEK 293T 细胞中的表达；免疫荧光实验观察人EBI3及各突变体在 COS7细胞中的定位。结果成功构建了下游携带FLAG 标签的人EBI3及其突变体的真核表达质粒；Western blot 结果显示重组蛋白均能在HEK 293T 细胞中稳定表达；经激光共聚焦显微镜观察,EBI3及其缺失突变体在COS7细胞的表达位置发生明显变化。结论人EBI3及其突变体真核表达质粒均能在HEK 293T、COS7细胞中成功表达；人EBI3缺失突变体在COS7细胞中的定位发生明显变化,氨基端结构域可能在EBI3蛋白的正确定位中发挥重要作用；EBI3蛋白的第210位Asp 的突变影响了其在细胞内的定位。
关键词： EBI3 质粒构建 Western blot 免疫荧光 -
RACK1及其缺失突变体与 CLIC1的共定位研究
目的：运用分子克隆技术构建活化蛋白激酶 C 受体1（RACK1）突变体的真核表达质粒，进行 RACK1突变体的表达、定位及其与胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）蛋白的共定位研究，为其进一步的功能研究奠定基础。方法以RACK1全长 cDNA 序列为模板，构建真核表达质粒 pcD-NA3．1-RACK1-N （1-138）-FLAG、pcDNA3．1-RACK1-C （130-317）-FLAG；Western blot 法检测突变体在哺乳动物细胞中的表达；用免疫荧光技术了解突变体蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。结果成功构建了 RACK1突变体的真核表达质粒；Western blot 法检测到蛋白主要在胞质中表达，核内有部分表达；免疫荧光实验表明，RACK1及突变体蛋白主要定位在胞质与核膜，细胞核中也有少量表达，与 CLIC1蛋白存在共定位。结论成功构建了 RACK1缺失突变体，并在真核细胞中成功表达；RACK1及突变体与 CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中均存在不同程度的共定位，蛋白之间可能存在相互作用，为 RACK1蛋白的功能研究奠定了基础。
关键词： RACK1 质粒构建 转染 免疫荧光 Western blot -
Claudin-1荧光真核表达载体的构建及其在HepG2肝癌细胞中的表达
目的 构建pDsRED1-Claudin-1重组质粒,并在HepG2肝癌细胞中进行表达.方法 采用基因重组技术构建含Claudin-1开放读码框(ORF)基因的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRED1-Claudin-1.经PCR、酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HepG2肝癌细胞后,进行荧光检测和Western blot分析.结果 成功构建真核表达质粒pDsRED1-Claudin-1,转染HepG2细胞后,经荧光检测和Western blot分析可见Claudin-1红色荧光融合蛋白正确表达.结论 成功构建含Claudin-1 ORF基因的红色荧光蛋白报告载体,并在HepG2肝癌细胞中正确表达.
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人Kiss-1重组质粒的构建及其对小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖能力的影响
目的 构建Kiss-1重组质粒,探讨过表达Kiss-1对体外培养的小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖的影响及其作用机制.方法 构建p-EGFP-N2-kiss-1重组质粒,通过脂质体体外转染至NCI-H446细胞；根据转染情况分为3组:Control组(转染p-EGFP-N2空载体)、转染组(转染p-EGFP-N2-kiss-1重组质粒)及未转染组(空白对照).Western blot检测经转染后的NCI-H446细胞中Kiss-1、mmp-9蛋白表达量的变化；流式细胞术检测Kiss-1蛋白对NCI-H446细胞增殖的影响.结果 成功构建p-EGFP-N2-kiss-1重组质粒并转染至小细胞肺癌细胞NCI-H446;转染Kiss-1明显抑制了NCI-H446的增殖；Western blot示转染组细胞内的Kiss-1表达增加,mmp-9蛋白表达减少.结论 过表达Kiss-1基因能抑制体外活化小细胞肺癌NCI-H446细胞的增殖；转染后细胞内mmp-9蛋白表达减少,推测其抗凋亡的作用可能是通过mmp-9产生的.
