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青少年起病的成人型糖尿病相关基因新突变位点的发现
目的 发现新的青少年起病的成人型糖尿病 (MODY) 相关基因或已知的相关基因的新突变位点,为临床上MODY的诊断提供依据.方法 以已知的MODY临床特征为筛选标准,从北京协和医院内分泌科就诊的患者中选取4例,提取其基因组DNA并进行全外显子组测序,用PCR及Sanger测序法对测序结果进行验证.结果 在2例患者中分别发现了MODY相关基因GCK和HNF4α的新的突变位点c.1348G>T (p.Ala450Thr) 和c.758G>A (p.Arg253Gln).结论2例患者均为MODY患者,所发现的MODY相关基因中的突变位点均为首次发现.
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肝细胞核因子4α在肝脏疾病中的研究进展
肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)是核激素受体超家族的一种转录因子,在调控肝细胞分化和维持肝脏生物学功能中起重要作用.近年研究发现,上调HNF4α的表达可阻断肝纤维化等肝脏慢性疾病进程,同时,HNF4α与乙肝病毒的转录和复制有关,本文就HNF4α在肝脏疾病中的作用机制的作一综述.
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HNF4α、HER4在胃癌中的研究进展
肝细胞核受体因子4α(HNF4α)是转录因子的核受体家族成员之一,它能精密调节染色体结构、激活靶基因,在肝脏疾病、结直肠疾病中的调控作用已被广泛认可,而近年HNF4α在胃癌中表达逐渐受到关注;第四人体表皮生长因子受体(HER4)为人类表皮生长因子受体家族(EGFR)的一员,EGFR的其他成员在胃癌中的作用得到肯定,而HER4在胃癌发展中的作用尚不明确,HNF4α、HER4均可能为胃癌的诊断及治疗提供新方向,本文就目前国内外HNF4α、HER4在胃癌中的研究进展作一综述.
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肝细胞核因子4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型建立及初步应用
目的 建立一种肝细胞核因子4α(HNF4α)增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型.方法 从临床获得的急性乙型肝炎患者血清中扩增并克隆HBV全长DNA;手术获得肝组织中提取总RNA,扩增并克隆HNF4α基因cDNA.BspQI/ScaI双酶切回收HBV全长DNA,HNF4α基因cDNA定向连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA3.1-4α表达载体.将HBV全长DNA 1 μg/孔,按比例共转染pcDNA3.1-4α(0,0.5 μg,1μg)于HepG2细胞,96 h后检测细胞上清中的HBsAg、HBeAg和HBV DNA;以0.5 μg/1 μg pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA共转染HepG2细胞,加入不同浓度LAM(0,100 μmol/L)和ETV(0,10 μmol/L),评价建立的体外复制模型.结果 1％ TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定HBV全长DNA和HNF4α cDNA PCR产物,条带长度为3.2 kb和1.5 kb;目的片段克隆后测序鉴定正确.胶回收HBV全长DNA克隆质粒酶切目的片段,构建的pcDNA3.1-4a表达载体酶切鉴定正确后,测序鉴定.不同浓度比例的pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA转染HepG2细胞后,0 μg/1 μg组合:HBeAg阴性,HBsAg阴性,上清HBV DNA载量为103;0.5 μg/1μg组合:HBeAg阴性,HBsAg A值从0.1升高到1.99,上清HBV DNA载量从1×103 IU/mL升高到4×104 IU/mL;1 μg/1 μg组合:HBeAg阴性,HBsAg A值从0.1升高到2.4,上清HBV DNA载量从1×103 IU/mL升高到1×105 IU/mL;LAM从0～100 μmol/L,细胞上清HBV DNA降低了97.6％;ETV从0～10 μmol/L,上清HBV DNA降低了99.0％.结论 HNF4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型,可以体外评价临床常用抗病毒药物,为后续HBV研究提供新思路.
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HNF4α与肝细胞分化调节
肝脏基因表达受肝富集转录因子(LETFs)的调控,这类肝脏内优势表达的转录因子在调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能发挥重要作用[1].肝细胞核因子(HNF)是LETFS的重要组成,HNF家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)、D结合蛋白(DBP),对肝脏基因特异性表达起着关键的调控作用.HNF4是一种细胞核激素受体超家族的转录因子[2],包括3个亚型:HNF4α,-4β,-4γ,其组织表达谱差异较大.HNF4α和HNF4γ具有70％同源性,DNA结合区的氨基酸序列非常类似.
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HNF4α真核表达载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达
目的:构建pcDNA3.1/HNF4α重组质粒,转染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs),并检测其在HUMSCs中的表达.方法:采用基因重组技术构建载体pcDNA3.1/HNF4α,经酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HUMSCs后,进行RT-PCR和Western blot分析,免疫荧光检测转染后1周肝特异性生化指标.结果:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1/HNF4α,转染人脐带间充质干细胞后,RT-PCR示转染后HNF4α mRNA表达,Western blot分析见HNF4cα蛋白表达,免疫荧光示转染1周后HNF4α促进了HUMSCs向肝细胞方向分化.结论:成功构建真核表达载体,并在HUMSCs中正确表达,为进一步研究HNF4α在干细胞向肝细胞分化中作用提供了实验基础.
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Tg737基因参与胎肝干细胞正常分化的机制研究
目的 探讨Tg737基因对胎肝干细胞(Fetal liver stem cells,FLSCs)正常分化的影响及相关机制.方法 三步分离法富集FLSCs;在HGF诱导FLSCs的不同时间点,RT-PCR检测AFP、ALB、Tg737及HNF4α的mRNA表达,Western blot检测Tg737和HNF4α的mRNA和蛋白表达;慢病毒Tg737-shRNA转染FLSCs,观察转染后Tg737的抑制效果;Tg737抑制后,RT-PCR检测不同诱导时间AFP和ALB的mRNA表达;Western blot检测Tg737抑制后HNF4α的蛋白表达.结果 三步分离法能有效富集FLSCs;在HGF诱导FLSCs的过程中,AFP的mRNA表达呈逐渐降低的趋势,ALB的mRNA表达逐渐升高,Tg737及HNF4α的mRNA和蛋白表达均呈逐渐升高的趋势;shRNA能有效下调Tg737的mRNA和蛋白表达;在HGF诱导过程中,Tg737抑制组AFP和ALB的mRNA水平均无明显变化;Tg737抑制后HNF4α的蛋白表达显著下调.结论 Tg737和HNF4α参与了FLSCs的正常分化,Tg737的表达缺失会抑制FLSCs的正常分化,其抑分化机制可能是通过下调HNF4α来实现的.
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金丝桃素在细胞水平对抗乙肝病毒新靶点 pgRNA的作用研究
乙型病毒性肝炎是由乙型嗜肝DNA病毒（ hepatitis B vi-rus， HBV）引起的一种世界范围内的传染性疾病，对人类健康危害重大［1］。目前，临床上应用广泛的抗乙肝病毒药物是拉米夫定（lamivudine，3TC）等核苷类化合物［2］，但长期应用核苷类药物，编码HBV DNA聚合酶／逆转录酶的基因区域会发生点突变而产生病毒耐药株，使得抗病毒效果大为下降［3］。因此，寻找新的抗病毒药物靶点成为乙肝研究中的重点与热点。金丝桃素（ hypericin，4，4′，5，5′，7，7′-六羟基-2，2′-二甲基［中位］萘骈二蒽酮），是贯叶连翘等金丝桃素植物的主要活性成分之一，有强效抗乙肝病毒活性，但与核苷类药物不同，其对HBV DNA聚合酶／逆转录酶无抑制作用，却可以明显下调pgRNA表达水平，提示其药物作用靶点可能与pgRNA相关［4］。本实验对金丝桃素抗乙肝病毒作用进行验证，并在此基础上对金丝桃素的可能靶点pgRNA以及靶点相关调控因子的表达进行了更加深入的研究。
