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TfR1mRNA和IRP1mRNA在不同铁状态孕妇胎盘中的表达
目的 测定转铁蛋白受体1(TfR1)和铁调节蛋白1(IRP1)在不同铁状态足月孕妇胎盘中的mRNA表达水平,探讨胎盘铁转运及调控机制.方法 采用RT-PCR方法测定正常组、铁缺乏(ID)组及缺铁性贫血(IDA)组足月孕妇胎盘中TfR1和IRP1的mRNA相对表达水平.结果 ①正常组TfR1 mRNA为0.4813±0.1891,ID组为0.6647±0.2788,IDA组为0.9767±0.2858,IDA组与正常组和ID组相比差异均有统计学意义(分别t=0.002,P＜0.01;t=0.028,P＜0.05),而ID组与正常组之间差异无统计学意义(t=0.117,P＞0.05).②正常组IRP1 mRNA为0.2616±0.0785,ID组为0.3696±0.1801,IDA组为0.3971±0.0902,各组间差异无统计学意义(F=1.845,P=0.179).结论 ①胎盘TfR1 mRNA随孕妇缺铁程度加重而增加,表明IRP1参与胎盘TfR1 mRNA的调节.②不同铁状态孕妇胎盘组织中IRP1 mRNA无量的显著变化,明确了IRP1发挥调节作用不是通过自身量的变化,但TfR1 mRNA表达水平的变化说明IRP1在胎盘铁代谢中发挥调节作用.
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低氧条件下铁调节蛋白1在维持SH-SY5Y细胞铁稳态中的作用
目的:研究低氧条件下铁调节蛋白1 (iron regulatory protein 1,IRP1)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞铁稳态的影响.方法:1％O2处理SH-SY5Y细胞0,1,2,4,6h,蛋白质印迹法检测铁蛋白轻链(ferritin light chain,Ft-L)以及膜铁输出蛋白(ferroportin,Fpn)的表达;Calcein-AM法检测SH-SY5Y细胞对Fe2+的吸收以及细胞可变铁池(labile iron pool,LIP);采用硫氰酸盐分光光度法测定细胞总含铁量;特异性siRNA下调IRP1后检测SH-SY5Y细胞低氧2h铁稳态的变化.结果:低氧0～6h,SH-SY5Y细胞Ft-L和Fpn表达增加,Fe2摄入和LIP增加,但细胞总铁水平不变.siRNA下调IRP1表达后再低氧2h,Ft-L蛋白表达和LIP明显增加,Fpn表达和Fe2+摄入没有明显变化,细胞总铁水平增加.结论:低氧条件下,IRP1是SH-SY5Y细胞铁稳态的重要调节者.
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铁调节蛋白1真核表达质粒的构建及功能初步研究
目的:构建人来源铁调节蛋白1(IRP1)真核表达质粒,检测该质粒在人肝癌细胞(HepG2)中的表达及其对转铁蛋白受体1(TfR1)和二价金属转运体1(DMT1)表达的影响.方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应获得IRP1的cDNA.根据不同的酶切位点分别构建IRP1 4个分段目的基因,依次连接4段基因并将其构建入真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列.用FuGENEHD将质粒pcDNA3.1 (+)-IRP1瞬时转染至HepG2.以QRT-PCR方法检测转染pcDNA 3.1(+)-IRP1质粒,观察对IRP1以及其调控基因TfR1和DMT1表达的影响.结果:扩增出IRP1全长cDNA,构建真核表达质粒,4个质粒经相应酶双酶切后,分子量分别为1261bp、502bp、600bp、310bp.经检测质粒转染至HepG2细胞后,IRP1表达显著高于转染空载质粒细胞.结果显示与对照组相比,转染真核pcDNA3.1(+)-IRP1质粒后IRP1表达显著上调约50倍,TfR1表达增加约3倍,DMT1表达增加约1.5倍,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建人IRP1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IRP1,并证明其能在HepG2细胞内高表达,从而影响IRP1调控基因的表达.
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SPIO标记对成骨样分化细胞IRP1基因及蛋白表达的影响
[目的]探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)标记大鼠脂肪间充质干细胞(RADSC)后,其成骨样分化细胞中铁调节蛋白1 (IRPl)基因及蛋白表达的变化.[方法]本实验采用转染剂多聚赖氨酸(PLL)介导SPIO标记RADSC,然后将其诱导为成骨样分化细胞,分别在诱导后0、7、14、21 d进行RT-PCR及Western blot检测其IRP1基因及蛋白的表达.[结果]成骨样分化细胞IRPl mRNA表达水平在SPIO标记与未标记组之间差异均无统计学显著性意义(F=1.571,P=0.239)；IRP1蛋白表达水平在标记与未标记组之间差异均无统计学显著性意义(F=0.547,P=0.500).[结论]SPIO标记并未对成骨样分化细胞的IRP1基因及IRP1蛋白表达产生明显影响.
