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锌α2糖蛋白真核表达载体的构建和体外表达鉴定
目的 构建小鼠锌α2糖蛋白(mZAG)真核表达载体,在体外培养细胞中鉴定其mRNA和蛋白水平表达.方法 提取小鼠肝组织总RNA,采用RT-PCR法扩增mZAG全基因表达序列,酶切法将mZAG cDNA全序列插入表达质粒载体pcDNA3.1(-)中构建pcDNA3.1(-)-mZAG真核表达质粒.采用阳离子脂质体转染法将不同浓度mZAG表达质粒(0、0.4、0.8、1.6ug)pcDNA3.1(-)-mZAG和4对mZAG小干扰RNA(siRNA)序列转染到3T3-Ll前脂肪细胞中,实时荧光定量RT-PCR测定mZAG mRNA表达水平,Western blot检测mZAG蛋白表达情况.结果 测序鉴定证实成功构建mZAG真核表达质粒pcDNA3.1(-)-mZAG.实时荧光定量RT-PCR检测结果显示,0.4、0.8、1.6μg mZAG转染组3T3-Ll细胞中的mZAGmRNA表达水平分别是0μg mZAG转染组的2.58(P=0.002)、3.67(P=0.000)、5.19倍(P=0.001);mZAG-siRNA1组和mZAG-siRNA4组小鼠3T3-L1细胞中的mZAG mRNA表达水平显著减少,分别是不转染mZAG siRNA干扰序列对照组的49%(P=0.002)和41%(P=0.000).Western blot检测结果显示,0.8μg mZAG质粒转染组的体外mZAG蛋白表达水平是不转染mZAG质粒对照组的2.75倍(P=0.017);mZAG-siRNA1和mZAG-siRNA4干扰序列转染组的体外mZAG蛋白表达水平仅为对照组的55%(P=0.004)和62%(P=0.025).结论 成功构建mZAG真核表达载体,该载体能够在体外细胞中良好表达.筛选出能够显著抑制mZAG表达的siRNA1和siRNA4,为今后进一步深入研究ZAG提供了有用工具.
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pTRE-2hyg-HBX质粒的构建和初步表达鉴定
目的:构建含HBV(hepatitis B virus)X基因的真核表达载体pTRE-2hyg-HBX,从而建立Tet-On表达系统,研究HBX基因与慢性肝炎和原发性肝细胞肝癌(HCC)的发生和发展的关系.方法:用PCR方法扩增含MIuI和SalI内切酶位点的X基因序列全长,对pTRE-2hyg载体和X基因的PCR产物进行双酶切(MIuI和SALI内切酶),将两者连接,转化大肠杆菌DH5α并提取转化子pTRE-2hyg-HBX,对其进行测序及其RT-PCR功能学检测.结果:已构建的pTRE-2hyg-HBX经测序包含有完整的X基因的片段并能表达.结论:构建成功pTRE-2Ehyg-HBX载体,可用于和pTET质粒共转化细胞系建立可调控的Tet-On表达系统,用于研究X基因与慢性肝炎和原发性肝细胞肝癌的发生和发展的关系.
关键词： HBx pTRE-2hyg-HBX 质粒构建 -
GST-G3BP Domain 1～5原核表达质粒的构建及其表达
目的:构建GST-G3BP Domain 1～5的融合表达质粒,并在大肠杆菌中稳定表达.方法:PCR扩增G3BP Domain 1～5片段,利用限制性内切酶geaR I和Not I将其连接至载体pGEX-4T-1,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序.将转化正确的大肠杆菌过夜培养,IPTG诱导融合蛋白表达,immobilized Glu-tathione beads钓取目的蛋白.结果:G3BP Domain 1～5片段均成功连接至载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的融合蛋白.结论:GST-G3BP Domain 1～5的融合表达质粒构建成功.
关键词： G3BP 质粒构建 GST-pull down 融合蛋白 -
重组CARDs TX融合蛋白的表达纯化与复性
目的:构建pET28α-CARDs TX重组质粒,诱导CARDs TX融合蛋白表达,并对其进行纯化与复性研究.方法:将CARDsTX基因(MPN 372)克隆入pET28α载体,经8次点突变获得pET28α-CARDs TX重组质粒.转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达.利用亲和层析技术纯化蛋白并通过SDS-PAGE和Western blot检测CARDs TX的表达和纯化效果.利用尿素梯度复性法和扩大体积透析法对蛋白进行复性研究.结果:酶切和测序结果证明pET28α-CARDs TX重组质粒的DNA序列完全正确,在BL21中CARDsTX融合蛋白可高效表达,并可获得高纯度目的蛋白.利用扩大体积透析法对目的蛋白复性有较好的效果.结论:成功构建出pET28α-CARDs TX重组质粒,且CARDs TX可在大肠杆菌中高效表达,并可获得高纯度的目的蛋白,为深入研究CARDs TX的生物学特性奠定了基础
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靶向FoxM1基因的短发夹RNA干扰表达载体的构建和鉴定
目的 构建靶向FoxM1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体质粒,为进一步探讨FoxM1在肺部恶性肿瘤及其他疾病中的作用奠定基础.方法 化学合成可编码靶向FoxM1基因的siRNA的短发夹DNA (shDNA)片段,通过基因重组将其插入到线性化的shRNA表达质粒骨架pSilencer 2.1-U6中,对得到的新质粒进行酶切鉴定和基因测序.结果 所构建的质粒载体中成功插入了可编码靶向FoxM1基因的siRNA的shDNA片段.结论 成功构建了靶向FoxM1基因的shDNA表达载体.
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神经营养素4前导序列介导Exendin-4表达质粒的构建及鉴定
目的：构建神经营养素4前导序列介导的可分泌表达Exendin-4的重组腺伴病毒载体，为探究Exendin-4用于2型糖尿病临床治疗提供实验基础。方法：使用互补引物/模板法及T载体克隆法扩增Exendin-4的cDNA克隆，连接于NT4前导肽序列的3′端，融合基因NT4- Exendin-4亚克隆于穿梭质粒pSSHG，转染HEK-293细胞，包装病毒，斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果：经酶切、测序证实克隆出Exendin-4 cDNA，成功构建同一开放读码框ORF的NT4前导肽Exendin-4 cDNA克隆，得到高滴度（2.5×109 pfu·L-1）的重组腺相关病毒。结论：通过分子克隆技术成功制备了Exendin-4的重组腺伴病毒载体pSSHG /NT4-Exendin-4并成功包装了较高浓度的重组病毒，为进一步研究Exendin-4功能及应用于临床打下基础。
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靶向核仁素RNA干扰载体的构建与筛选
目的:设计靶向大鼠核仁素的RNAi序列,构建6个RNAi真核表达载体,采用转染工具细胞筛选有效靶点.方法:根据GenBank中的核仁素序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至pGCsilencerTMU6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,将重组质粒用脂质体转染技术导入H9C2细胞,荧光显微镜检测GFP表达以判断转染效率,Western-blot检测靶细胞中核仁素蛋白水平的表达,筛选有效干扰序列.结果:经测序鉴定,克隆的RNAi打靶序列完全正确,无碱基突变.转染H9C2细胞36 h后,荧光显微镜下可检测到GFP标记的核仁素蛋白的表达,转染效率达75%以上.Western-blot结果显示3号核仁素干扰质粒(Ncl-3)能明显下调H9C2细胞的核仁素表达.结论:成功构建靶向核仁素RNA干扰载体,并筛选出效能优序列,为进一步相关研究奠定基础.
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荧光共振能量转移技术阳性参照质粒的构建及应用
目的 构建青色荧光蛋白(CFP)基因和黄色荧光蛋白(YFP)基因相连接的真核表达载体pYFP-CFP,并检测融合蛋白CFP-YFP的FRET转移效率,为FRET技术提供阳性参照物. 方法 利用基因重组法,以带有CFP基因序列的质粒(pCFP)为模板,扩增CFP基因并插入黄色荧光蛋白载体(pYFP)的多克隆位点中,构建真核表达质粒pYFP-CFP.经细胞转染后,使其表达CFP和YFP相连的融合蛋白.在激光共聚焦显微镜下采集FRET信号图和FRET转移效率(EFRET)的计算,并比较和分析表达CFP-YFP的阳性细胞与CFP和YFP共表达的阴性细胞. 结果 真核表达质粒pYFP-CFP构建成功,并在细胞质中表达,这与pCFP和pYFP共转染的细胞中荧光蛋白的分布略有不同,后者在细胞胞质和细胞核中均有表达.统计结果显示表达融合蛋白的阳性组EFRET明显高于共表达的阴性组,差异有统计学意义. 结论 融合荧光蛋白分子的青色和黄色蛋白之间具有10个氨基酸残基相连,符合FRET现象发生的条件,能够采集到很强的FRET信号,可作为FRET研究的稳定阳性实验参照.
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人纤溶酶原丝氨酸蛋白酶( SP )活性区基因的克隆、表达与功能研究
目的 克隆和表达人纤溶酶原( plasminogen,Plg)的丝氨酸蛋白酶( SP)活性区基因μplg,并进行重组蛋白的纯化及功能探索. 方法 用PCR方法从pDNR-plg质粒上扩增μplg,构建原核表达载体pET22b(+)-μplg,IPTG诱导重组蛋白表达后复性,再经Ni+-NTA树脂亲和层析纯化,通过与双歧杆菌外膜蛋白Serpin的共孵育实验来探索μPlg的功能. 结果 PCR成功扩增出了680 bp的人纤溶酶原Plg的SP区基因μplg,测序正确后与表达载体pET22b(+)重组,重组质粒pET22b(+)-μplg在大肠杆菌BL21中成功表达出分子量约为35 kD的μPlg蛋白质,经纯化后的蛋白纯度高达约90%以上,与Serpin蛋白共孵育后得到了二者的复合物. 结论 人纤溶酶原μPlg的成功克隆、表达及纯化对于研究SP区功能和与双歧杆菌的黏附作用有重要意义.
关键词： 人纤溶酶原 丝氨酸蛋白酶(SP) 活性区 μplg 质粒构建 -
维甲酸受体变异蛋白酵母双杂交诱饵载体构建
目的 构建维甲酸受体变异蛋白(RARα-V)的诱饵表达载体.为应用酵母双杂交系统筛选与RARα-V相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增RARα-V,克隆入诱饵载体pGBKT7中,将构建好的诱饵载体pG-BKT7一RARα-v转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果 成功扩增了RARα-V基因片断,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性,无自激活和渗漏,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论 成功构建了RARα-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步筛选与之相互作用的蛋白提供基础依据.
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TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建
目的 克隆人转化生长因子β1(TGF-p1)和4个受体基因片段,构建酵母表达载体,为应用酵母双杂交筛选与TGF-βl相互作用的TβRⅡ区域提供技术支持.方法 提取人血液中RNA,逆转录转为cDNA,PCR扩增TGF-β1和4个受体(TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C、TβRⅡ-D)基因片段,双酶切后,分别插入酵母双杂交表达载体pGBKT7和pGADT7;经过PCR扩增、双酶切和DNA测序鉴定后,构建质粒pGBKT7-TGF-β1和pGADT7-TβRⅡ-A、pGADT7-TβRⅡ-B、pGADT7-TβRⅡ-C和pGADT7-TβRⅡ-D.结果 成功扩增TGF-βl基因(1 200 bp)和TβRⅡ-A(453 bp)、TβRⅡ-B (366 bp)、TβRⅡ-C (276 bp)和TβRⅡ-D(165 bp)基因片段,经PCR、双酶切和DNA测序鉴定插入到酵母双杂交载体序列正确.结论 成功构建pGBKT7-TGF-β1和pGADT7-TβRⅡ-A、pGADT7-TβRⅡ-B、pGADT7-TβRⅡ-C和pGADT7-TβRⅡ-D酵母双杂交表达载体.
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CSL载体构建表达纯化及活性鉴定
目的 构建Calpastatin N末端结构域Calpastatin domain L(CSL)(a.a.150-230)融合蛋白质粒,表达、提取、纯化CSL蛋白并进行生物学活性鉴定.方法 将CSL的cDNA片段插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达,超声破碎法提取CS;蛋白.利用Glutathione-Sepharose 4B(GS-4B)beads和PreScission蛋白酶分离纯化蛋白,pull down assay检测其生物学活性.结果 CSL质粒经测序比对后表明构建成功;超声破碎法提取的CSL蛋白纯度和浓度均较高,并具有能够与GST-CT1融合蛋白浓度依赖性结合的生物学活性.结论 成功构建CSL融合蛋白质粒,提取纯化具有生物活性的CSL蛋白,为探讨Cav1.2钙通道自身调节机制奠定基础.
关键词： 钙蛋白酶抑素 Pull down assay 质粒构建 -
β-catenin基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位
目的 构建β-eatenin真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 提取工具细胞NIH3T3的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增β-catenin基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中.进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞NIH3T3细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-β-catenin在NIH3T3细胞内的定位.结果 β-catenin基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2346 bp,并测序成功.Western blot检测到了GFP-β-catenin融合蛋白表达,分子量约为115kDa.pEGFP-p-catenin在工具细胞NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质.结论 成功构建了β-catenin基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-β-catenin蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质.
关键词： β-catenin基因 质粒构建 NIH3T3细胞 基因表达与定位 -
人Plk3基因真核表达载体的构建及蛋白表达和定位
目的 构建hPlk3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hPlk3基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中.然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测其表达.后利用激光共聚焦扫描显微镜观察pEGFP-hPlk3在COS-7细胞内的定位.结果 hPlk3基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1941bp,并测序成功.Western blot检测到了GFP-hPlk3融合蛋白表达,分子量约为98kDa.pEGFP-hPlk3在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周.结论 成功构建了hPlk3基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPtk3蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周.
关键词： hPlk3 Western blot 绿色荧光蛋白 质粒构建 COS-7细胞 -
hLMO3基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位
目的 构建hLMO3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO3基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO3在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO3基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为440 bp;Western blot检测到融合蛋白在HEK293细胞表达,分子量约为42kDa,pEGFP-LMO3在人HEK293细胞中主要定位于细胞核内.结论 成功构建了hLMO3基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO3蛋白在HEK293细胞中主要定位于细胞核内.
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犬黑皮质素受体3原核表达载体的构建与表达
背景:近年黑皮质素受体家族在体内能量平衡中的作用越来越受到重视.黑皮质素受体3基因突变是引起体质量增加的重要因素之一,但是目前对黑皮质素受体3的深入研究很少,且未见在蛋白水平上检测其表达的单克隆抗体.目的:构建犬黑皮质素受体3基因编码区的原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达.方法:以Beagle犬基因组DNA为模板,设计特异性引物,经PCR技术扩增目的片段后,克隆到pMD18-T载体上,双酶切鉴定以后将目的基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coli DH5α,筛选阳性克隆,DNA测序检测插入序列的正确性.将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R转化到E.coli BL21内,经IPTG诱导后,利用Western blot检测犬黑皮质素受体3融合蛋白的表达.结果及结论:成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R,经DNA测序证实插入序列与Genebank上公布的序列一致.此重组体经诱导后能在E. coli BL21内表达犬黑皮质素受体3融合蛋白,为进一步获取犬黑皮质素受体3的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究大黑皮质素受体3蛋白的结构和生理功能提供帮助.
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雄激素受体基因第一外显子区CAG缺失的构建及其在HEK293细胞中的表达
目的:构建雄激素受体基因第一外显子区CAG重复序列缺失的突变重组体,观察CAG重复序列的有/无对雄激素受体转录及表达的调控作用.方法:实验于2006-05/2007-05在解放军总医院老年医学研究所完成.按照重叠延伸反应的原理扩增CAG重复序列两端的基因片段,再将两片段混合,在加入一个引物的情况下进行8个PCR循环以有效完成重叠延伸,然后再加入另一引物进行22个循环,完成目的片段指数扩增,将目的片段克隆至真核表达载体PAR-IRES2-EGFP,转染HEK293细胞,采用Western blot法检测HEK293细胞雄激素受体蛋白.结果:构建的CAG重复序列缺失的突变重组体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,转染真核细胞可检测到雄激素受体基因的表达.结论:重叠延伸PCR是进行体外基因拼接、体外缺失突变的简单、快速的基因重组技术;雄激素受体基因第一外显子区CAG重复序列缺失的突变重组体的成功构建可为今后的相关研究提供实验基础.
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hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位
目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.
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血小板源性内皮细胞生长因子小干扰RNA质粒的构建和鉴定
目的构建针埘血小板源性血管内皮生长因子(PDECGF)小干扰RNA(siRNA)表达质粒和阴性对照质粒pIASRC-PDECGF,并观察对PDECGF表达的影响.方法构建针对PDECGF siRNA表达质粒pIASR-PDECGF和阴性对照质粒pIASRC-PDECGF,将沟建成功的质粒转染大肠癌细胞株GC7901,观察阳ECGF蛋白表达的影响.结果成功构建针对PDECGF siRNA表达质粒pIASR-PDECGF,并发现它能够明显抑制PDECGF的表达.而阴性对照质粒则无此作用.结论血小板源性内皮细胞生长因子小干扰RNA能够特异性抑制PDECGF的表达.
关键词： 小干扰RNA 质粒构建 血小板源性血管内皮生长因子 -
YAP干扰质粒的构建及转染肺腺癌细胞A549的筛选鉴定
目的：构建YAP基因小发卡RNA（ shRNA），并转染人肺癌A549细胞株，建立稳定低表达YAP基因的肺癌细胞系。方法根据信息检索，分别构建4个shRNA（shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4）质粒表达载体和一个阴性对照表达载体（NCRNA），脂质体法转染人肺癌A549细胞株，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，有限稀释法建立稳定低表达YAP基因的A549细胞系，RT-PCR和Western印迹检测 YAP在该细胞中的表达。结果转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达，RT-PCR和Western印迹检测到目的基因YAP在转染细胞中为低表达。 RT-PCR检测YAP mR-NA示shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，NCRNA组和空白对照组的2-ΔΔct值分别为2．775，0．498，0．432，2．834，3．289，3．320。 Western印迹检测示shRNA1组，shRNA2组，shRNA3组，shRNA4，NCRNA组，空白对照组的蛋白相对灰度值分别为0．690，0．411，0．354，0．688，0．699，0．712。结论成功构建了靶向YAP基因的shRNA，筛选出了干扰作用为明显的shRNA，并建立了稳定低表达YAP基因的A549细胞系。
