首页 > 文献资料
-
人CD40-Ig融合蛋白表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达
CD40/CD40L途径是除B7/CD28途径之外的重要的共刺激信号转导途径,在T细胞活化过程中扮演着十分关键的角色.因而,该途径可能在同种移植排斥的诱导和效应阶段的不同时期发挥关键作用.本研究旨在获得人CD40分子胞外区和人IgG 1 Fc段的融合蛋白,以探索阻断CD40/CD40L共刺激途径在免疫治疗中的潜在应用.首先,从人B淋巴瘤细胞系Daudi中提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术扩增人CD40分子胞外区基因,将扩增产物连接入pGEM T Easy载体中构建克隆载体pGE40,利用全自动DNA测序仪进行序列测定.将测序正确的胞外区片段插入至含人IgG 1类抗体重链基因组序列的pIG 1载体中构建瞬时表达载体,命名为pIG/40 Ig.用DEAE-Dextran/Chloroquine法转染COS-7细胞,夹心ELISA法和Western印迹分析鉴定培养上清中CD40-Ig融合蛋白的表达及免疫学活性.在重组载体pIG/40 Ig转染COS-7细胞后,ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达;Western印迹鉴定发现在相对分子量50 kD左右有一特异条带,该分子可同时被抗人CD40单抗G28-5和抗人Ig γ链的单抗识别.本研究成功地扩增人CD40基因并构建了人CD40-Ig融合基因表达载体,在C0S-7细胞中获得功能性表达,为进一步研究CD40/CD40L途径在移植物抗宿主病的预防与治疗中的可能作用奠定了基础.
-
血管生成素在COS-7细胞中的表达及其生物活性研究
本研究旨在实现血管生成素(ANG)在真核细胞中的表达并探讨其生物学功能.通过RT-PCR获得ang基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-ang,在转染COS-7细胞后进行瞬时表达,通过Western blot对表达产物进行鉴定.利用MTT法分析表达上清对ECV304细胞的促增殖作用,同时利用鸡胚分析表达上清的促血管生成作用.结果表明:瞬时转染后细胞培养上清中有重组ANG的表达,并能与抗-ANG单克隆抗体发生特异性反应.与转染空载体的对照相比,转染pcDNA3.1-ang的细胞培养上清具有促进ECV304细胞增殖的作用,并能显著促进鸡胚尿囊膜血管生长.结论:ang可在COS-7细胞中瞬时表达,其表达产物具有显著的促细胞增殖和促进血管生成的作用.
-
二苯乙烯苷对过度表达α-synuclein蛋白的转基因COS-7细胞株的影响
目的 观察二苯乙烯苷(TSG)在体外试验中对COS-7细胞株过度表达α-synuclein蛋白的影响.方法 将不同浓度的TSG与转染α-synuclein基因的COS-7细胞共孵育24 h,应用二甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,免疫细胞化学和Western免疫印迹法检测α-synuclein蛋白的表达,观察TSG对其的影响.结果 TSG在12.5～200.0 μmol/L浓度范围内与COS-7细胞孵育24 h不影响细胞存活率,而在免疫细胞化学和Western免疫印迹分析中均显示TSG剂量依赖性地抑制α-synuclein蛋白表达和聚集.结论 TSG在体外对COS-7细胞过度表达α-synuclein有明显抑制作用.
关键词： 二苯乙烯苷 何首乌 α-synuclein COS-7细胞 体外试验 -
乙酰肝素酶信号肽对其活性功能的影响研究
目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移过程中起关键作用,其信号肽在该酶翻译后处理过程中起重要作用.本研究旨在探索乙酰肝素酶在哺乳动物细胞中的表达特性及其信号肽对此酶功能活性的影响.方法:从人胎盘cDNA文库中扩增乙酰肝素酶全长编码基因,克隆入pGEM-T载体中,测序鉴定序列完全正确后,将此基因的全长和不含信号肽基因序列分别克隆入真核表达载体pcDNA4.1/Myc-His中构建pcDNA4.1/Myc-His full HPA和pcDNA4.1/Myc-His part HPA,转化COS-7细胞进行瞬时表达,分析这两种乙酰肝素酶蛋白的表达特性及功能活性.结果:在转染了乙酰肝素酶全基因的COS-7细胞裂解液中检测到该酶的功能活性及大小约53×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,为切割激活后乙酰肝素酶羧基端大亚基与标签蛋白的融合体.在转染了敲除信号肽的乙酰肝素酶基因的COS-7细胞裂解液中测到未被切割激活的大小约65×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,未能检测到该酶的功能活性.结论:在COS-7细胞中表达的完整的乙酰肝素酶蛋白和不含信号肽的乙酰肝素酶蛋白均位于细胞内,没有或很少被分泌到细胞外,提示该酶在正常状态下主要分布在细胞内.含信号肽的酶蛋白在翻译后处理过程中被细胞内的蛋白酶切割成2个亚基而被激活,具有功能活性.而不含信号肽的酶蛋白没有被切割而成为有活性的酶,提示乙酰肝素酶的信号肽对其翻译后加工、激活过程有重要的影响.
-
蚓激酶基因在真核细胞COS-7中的表达
目的:为了实现蚓激酶基因片段F-3,F-5在真核细胞COS-7中的表达,获得具有生物学活性的重组蚓激酶蛋白.方法:将F-3,F-5与分泌表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建重组表达质粒pcDNA-3和pcDNA-5,利用COS-7细胞进行基因F-3和F-5的瞬时表达;纤维蛋白平板法对培养液上清进行活性检测.结果:蚓激酶基因片段F-3,F-5在真核细胞COS-7 中实现了表达;SDS-PAGE显示蛋白质条带,纤维蛋白平板法检测培养液上清有明显的纤溶活性.结论:蚓激酶基因片段F-3,F-5可在真核细胞COS-7中分泌表达,表达产物具有一定的纤溶活性.
-
6A8α-甘露糖苷酶酶解p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside
目的明确6A8 cDNA编码蛋白质的α-甘露糖苷酶性质.方法利用基因重组技术将克隆到的3个DNA片段拼接成完整6A8 cDNA,将其插入到真核表达载体pCDI,转染COS-7细胞,用酶活性检测与Western blot对瞬时表达的蛋白质的性质进行鉴定.结果拼接后的cDNA片段经测序完全符合6A8 cDNA碱基顺序.转染重组表达载体pCDI-6A8的COS-7细胞的匀浆对p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside的酶解作用为转染空载体pCDI的细胞及野生型细胞的3～4倍,且这种酶解作用不能被swainsonine所抑制.Western blot检测显示在相对分子质量(Mr)120 000处有一明显蛋白带,此带的显影于转染pCDI-6A8 cDNA的细胞明显深于转染空载pCDI及野生型细胞.结论6A8 cDNA编码的蛋白质确为一种α-甘露糖苷酶,属于Ⅱ类α-甘露糖苷酶.
-
人Plk3基因真核表达载体的构建及蛋白表达和定位
目的 构建hPlk3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hPlk3基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中.然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测其表达.后利用激光共聚焦扫描显微镜观察pEGFP-hPlk3在COS-7细胞内的定位.结果 hPlk3基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1941bp,并测序成功.Western blot检测到了GFP-hPlk3融合蛋白表达,分子量约为98kDa.pEGFP-hPlk3在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周.结论 成功构建了hPlk3基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPtk3蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周.
关键词： hPlk3 Western blot 绿色荧光蛋白 质粒构建 COS-7细胞 -
人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的真核共表达质粒
背景:一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体,可提高转染和表达效率.目的:利用多形上皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin,MUC1)多肽骨架中含有许多连续重复系列,构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony sfimulating factor,GM-CSF)基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1(+).MUCI-GM-CSF,并观察重组质粒存COS-7细胞中的表达.设计、时间及地点:基因重组体设计实验,于2005-09/2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成.材料:真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Taylor-Papadimitriou 教授惠赠.pGEM.3zf(-)-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E.coli DH5 α为自备,雌性BALB/c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供.方法:将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后,与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF.以重组质粒转染COS-7细胞.主要观察指标:通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达.结果:酶切鉴定及序列分析表明,重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因,在COS-7细胞中可检测到MUC1表达,重组质粒免疫小鼠可诱导产牛抗GM-CSF抗体.结论:成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM-CSF基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒.
-
人IL-24基因的克隆及在COS-7细胞中的表达
目的:克隆人IL-24基因,构建真核表达载体,在COS-7细胞中进行表达,并检测重组表达蛋白hIL-24的抗肿瘤活性.方法:分离人外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术克隆人IL-24基因,将其重组于pUC19,双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列,构建真核重组表达载体pcDNA3-hIL-24,进行双酶切和PCR鉴定,以质粒pcDNA3-hIL-24转染COS-7细胞进行瞬时表达,用RT-PCR检测mRNA表达,并用MTT法、TUNEL法和流式细胞术检测其诱导肿瘤细胞凋亡的活性.结果:成功获得621 bp的人IL-24基因,测序正确,经双酶切和PCR鉴定真核表达质粒构建正确,以脂质体转染COS-7细胞后,用RT-PCR法、MTT法、TUNEL法和流式细胞术检测表明COS-7细胞可表达hIL-24,且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549肺腺癌细胞凋亡的作用.结论:人IL-24基因的瞬时表达和凋亡效应的初步研究已获成功,为研究人IL-24抗肿瘤的分子机制和临床应用提供了实验依据.
-
hIEN-λ1(hIL-29)基因及在COS-7细胞中瞬时表达和抗病毒效应
目的:克隆hIFN-λ1基因,构建pcDNA3.1 A-IFN-λ1表达质粒,并在真核细胞中获得表达,以进一步研究rhIFN-λ1的生物学特性.方法:采用RT-PCR法从病毒诱导的A549细胞mRNA中克隆hIFN-λ1基因,并重组于pcDNA3.1A真核表达载体上.结果:经双酶切和PCR鉴定及DNA序列分析,发现所克隆的基因与GenBank公布的序列一致,并在COS-7细胞中获得了有效瞬时表达.结论:成功克隆了hIFN-λ1基因,并成功地获得了瞬时表达,其rhIFN-λ1表达产物具有抗病毒活性.
-
人FL基因高效真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的：构建人FL真核表达载体-pIRES1neo/hFL，观察其在COS-7细胞中的表达。方法：采用RT-PCR方法自人白血病细胞系TF-1中克隆可溶型FL(Flt3-ligand)cDNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体-pIRES1 neo中的EcoR I和BamHI位点，构建hFL真核表达载体-pIRES1neo/hFL。脂质体介导法将其转染COS-7细胞，72h以RT-PCR检测转染细胞中外源hFL基因的转录、ELISA法及脐血CD34+细胞增殖实验测定转染细胞上清中hFL的含量和活性。结果：酶切鉴定表明成功构建了重组真核表达载体-pIRES1neo/hFL；外源hFL基因能在转染细胞中有效转录；ELISA法测得72 h后培养上清中的hFL含量为每24小时251 ng/106 cells，并且分泌的hFL具有良好的生物学活性。结论：构建hFL真核表达载体在COS-7细胞中具有良好的表达活性。
-
狂犬病病毒糖蛋白真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的 构建狂犬病病毒糖蛋白基因的真核细胞表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法 培养狂犬病病毒, 提取负链RNA,采用RT-PCR的方法扩增糖蛋白基因,并将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(A)上,通过脂质体介导的方法,转染COS-7细胞,用ELISA及间接免疫荧光法检测狂犬病病毒糖蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达.结果 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(A)/G,转染COS-7细胞后,在其培养上清中未检测到狂犬病病毒糖蛋白的表达.间接免疫荧光试验表明,pcDNA3.1(A)/G能有效地表达狂犬病病毒糖蛋白于转染的COS-7细胞膜上.结论 真核细胞表达载体pcDNA3.1(A)/G能够在COS-7细胞中表达狂犬病病毒糖蛋白,为开发狂犬病病毒糖蛋白基因工程疫苗奠定了基础.
-
人乳头瘤病毒16型晚期蛋白真核表达质粒的构建
目的克隆宫颈癌病理组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期蛋白(L1)的基因,并构建真核表达质粒,为制备预防性疫苗奠定基础.方法采用PCR法从宫颈癌病理标本中扩增出HPV16 L1基因,与pMD18-T载体连接,测序并构建真核表达质粒(pVAX1-L1),瞬时转染Cos-7细胞,利用免疫组化技术检测表达产物.通过小鼠淋巴细胞转化试验检测免疫原性.结果所得L1基因的序列与GenBank中序列比较存在若干变异,并由此引起相应的氨基酸发生变化.pVAX1-L1瞬时转染Cos-7细胞,经免疫组化技术检测到棕黄色免疫复合物的形成,说明有表达产物L1蛋白产生.淋巴细胞转化试验结果显示,试验组与对照组差异有显著意义.结论宫颈癌病理组织中HPV16 L1基因序列存在一定程度的变异,所得L1基因表达产物具有生物学活性.
-
EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体的构建及其转染COS-7细胞条件的优化
目的 构建EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化PEI介导基因转染COS-7细胞的条件.方法 PCR扩增EGFP和PDGFRβ基因,依次连接至pcDNA3.1(+)质粒中,构建融合基因表达载体H-E-P-pcDNA3.1(+),经PEI介导转染COS-7细胞,并对转染条件进行优化.结果 融合基因表达载体经酶切及测序证明构建正确.经PEI介导转染COS-7细胞的佳条件为:DNA浓度2 μg/ml,N/P比值15.5,在无血清条件下转染.此条件适用于滚瓶培养细胞的转染.结论 已成功构建了EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化了经PEI介导转染COS-7细胞的条件.
-
新型聚乙烯亚胺衍生物在COS-7细胞中转染和毒性的研究
目的:研究以乙二醛为连接剂的聚乙烯胺(Polyethyleneimine,PEI)衍生物Polyimine-PEI对非洲绿猴肾癌细胞COS-7的转染活性和细胞毒性的影响.方法:以荧光素酶质粒为报告基因,研究高分子与DNA的复合物在COS-7细胞的转染活性,用MTT 方法研究高分子对COS-7细胞的毒性.结果:COS-7细胞实验显示,Polyimine-PEI具有很低细胞毒性,其毒性显著低于PEI25kDa,同时也具有高效输送质粒的能力.结论:Polyimine-PEI是一种新型的高效,低毒在基因治疗领域有相当前景的非病毒载体.
-
周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的克隆与真核表达
目的 克隆和表达周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)的编码基因.方法 依据公布的BmGAPDH基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克隆后,克隆至载体pGEM-T Easy中,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)对获得重组蛋白(rBmGAPDH)进行分析和鉴定.结果 转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的 基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的结果 一致.SDS-PAGE分析显示重组蛋白rBmGAPDH相对分子质量(Mr)约为43 000.结论 成功进行了BmGAPDH编码基因的克降和真核表达.Cloning,weukaryotic expremion of the gene encoding glyceraidehydes-3-phosphate dehydrogenase from periodic Brugia malayi XIE Dong-fimg,FANG Zheng,HUANG Wei-qun,SHEN Qin,TONG Hai-yan,XUBang-sheng.
关键词： 周期型马来丝虫 3-磷酸甘油醛脱氢酶 真核表达载体 COS-7细胞 -
异嗜性小鼠白血病病毒感染性DNA转染COS-7细胞后形成病毒颗粒的电镜观察
目的检测异嗜性小鼠白血病病毒感染性DNA(pXeno.inf)转染C OS-7细胞后形成病毒颗粒的能力. 方法采用脂质体转染方法 ,将异嗜性小鼠白血病病毒感染性DNA 转染至COS-7细胞后,用电镜观察该细胞中病毒颗粒的形成情况. 结果在异嗜性小鼠白血病病毒感染性DNA转染后的 COS-7细胞胞浆中,可以见到少量病毒颗粒的存在,并且转染后细胞表现出相应的病理变化. 结论证实异嗜性小鼠白血病病毒感染性DNA在COS-7细胞中具有形成病毒颗粒的能力.
-
大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的:构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中.经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接.将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中,用RT-PCR鉴定BDNF mRNA的表达,免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平.结果:克隆了BDNF的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性；免疫印迹法分析显示,转染48 h时,COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主,在96 h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主.结论:成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达,BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外,在不同时间点分泌组合不同.
关键词： 脑源性神经营养因子基因 重组质粒 基因表达 COS-7细胞 -
人CCL21基因真核表达载体的构建及表达
为了构建可在哺乳动物细胞内高效表达人次级淋巴组织趋化性细胞因子(hCCL21)的真核表达质粒pVAX1-hCCL21,以便用于hCCL21基因治疗研究.以BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切重组克隆pSK-hCCL21,胶回收约540 bp的hCCL21目的基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点,转化后进行菌落PCR分析和BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定.阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,Western blot法检测转染细胞中hCCL21的瞬时表达,趋化小室法检测表达产物对淋巴细胞的免疫趋化作用.结果显示,菌落PCR和酶切鉴定证实,目的基因hCCL21正确插入到真核表达载体pVAX1中,转染COS-7细胞后,细胞培养上清及裂解产物中可检测到重组蛋白hCCL21的表达,并且表达产物对人外周血单个核细胞有明显的趋化活性.已成功构建了可在哺乳动物细胞内高效表达hCCL21基因的真核表达质粒pVAX1-hCCL21,为进一步研究hCCL21基因治疗肿瘤奠定了基础.
-
马来丝虫肌球蛋白部分编码基因Bm-M55的克隆与真核表达
根据马来丝虫肌球蛋白部分编码基因(Bm-M55)序列设计引物,以其微丝蚴总RNA为模板,反转录PCR扩增目的 基因.用TA克隆方法将目的 基因克隆至载体pGEM-T Easy中,经PCR和双酶切鉴定并测序后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/Bm-M55,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证.用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)对获得重组蛋白Bm-M55进行分析和鉴定.RT-PCR鉴定结果显示,转染的COS-7细胞表达了Bm-M55基因.根据克隆的目的 基因序列推导的氨基酸序列与GenBank(登录号为AAA27858)中的一致,重组蛋白Bm-M55相对分子质量(Mr)约为55 000.
