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抑制聚ADP核糖聚合酶1活性的短发夹RNA载体构建
目的构建抑制人聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)活性的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体.方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向hPARP1基因的寡核苷酸,各69对碱基,退火,然后利用BamHⅡ及EcoRⅠ与pSIREN-RetroQ载体连接.用EcoRⅠ及BglⅡ切取其中U6启动子及下游的shRNA部分,与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-shRNA载体.结果重组构建的pEGFP-C1P1、pEGFP-C1P2、pEGFP-C1N载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明330个碱基成功插入到预计位点.结论载体的成功构建,为进一步研究聚ADP-核糖聚合酶在DNA修复过程中的功能打下基础.
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慢病毒介导双shRNA靶向于HIV的抑制作用研究
RNA干扰可以有效地抑制特定基因的表达,在HIV基因治疗中成为一种重要的方法.为了防止病毒逃逸株的出现,本研究分别构建了靶向于HIV-1调控蛋白基因vpr和tat的shRNA重组慢病毒载体以及含有这两种shRNA的双表达重组慢病毒载体,分别由U6和H1两种启动子启动,通过与靶向基因tat和vpr表达质粒在293T细胞中进行共转染,采用荧光定量PCR方法测定细胞内靶向基因的表达丰度,结果显示双表达shRNA的重组慢病毒载体对vpr和tat的表达抑制率分别可以达到89.20％和62.00％.与pNL4-3病毒包装质粒共转染,P24ELISA显示plvx-vpr-tat shRNA对病毒包装产量的抑制率可以达到99.05％,比单个shRNA的抑制率都要强,HIV-1 NL4-3体外对MT4细胞攻毒实验表明双shRNA重组慢病毒载体具有很强的抑制病毒复制的能力.
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慢病毒介导的靶向NDV P基因shRNA对NDV复制的抑制作用
小干扰RNA(siRNA)诱导的RNA降解可以特异性地抑制病毒感染,它作为一种有效的抗病毒治疗方法正被广泛研究.为了探讨慢病毒介导的shRNA对NDV复制的抑制效果,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础,本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)P基因为靶基因,构建了靶向NDV P基因的shRNA重组慢病毒表达载体RNAi-341和RNAi-671.将其与辅助细胞共转染293T细胞,获得包装好的重组慢病毒;在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)和SPF鸡胚上进行了干扰实验,并通过荧光定量PCR和病毒滴度测定检测shRNA对NDV的抑制效果.结果发现,RNAi-341和RNAi-671均能抑制FLAG-P蛋白在293T细胞中的瞬时表达.在CEF细胞感染后16h后,NDV的病毒滴度分别降低了66.6倍和30.6倍;在鸡胚感染48h后,RNAi-341和RNAi-671组NDV病毒的增殖量分别减少99％和98％.RNAi-341与RNAi-671不仅能抑制P基因的转录,还能显著降低NP、M、F、HN和L基因的转录水平.与RNAi-671相比,RNAi-341的抑制效果更好.研究结果表明,慢病毒介导的靶向P基因的shRNA具有抗病毒作用,能够抑制NDV在CEF和鸡胚中的复制,从而为临床防治NDV提供一个新方法.
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针对NSP4基因的shRNA抑制牛轮状病毒的体外增殖
本研究根据牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的NSP4基因序列,设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89,利用脂质体介导法,将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞,包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV,以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照,48h后与LacZ shRNA对照比较,RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明,针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明,在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中,病毒滴度分别是对照组的50%、20%和10%.上述实验结果表明,针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因,并且能阻断牛轮状病毒增殖.
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Livin通过Akt信号途径促进胃癌SGC7901细胞的上皮细胞间质转换
目的 探讨胃癌SGC7901细胞中Livin基因的表达对细胞上皮细胞间质转换(EMT)的影响.方法 用Livin基因的shRNA慢病毒感染胃癌SGC7901细胞,筛选稳定沉默的细胞株,Transwell检测细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测E-cadherin和vimentin表达,同时检测Akt信号通路的激活状态.结果 沉默Livin基因后,胃癌SGC7901细胞侵袭迁移能力明显降低(P＜0.05),E-cadherin明显上调,vimentin则明显下调(P＜0.05),同时明显抑制Akt信号通路信号的激活(P＜0.05).结论 Livin能够通过激活Akt信号通路从而诱导SGC7901细胞发生EMT,从而促进肿瘤细胞体外侵袭及迁移能力.
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靶向COL1A1基因的shRNA对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭与迁移的影响
目的 探讨Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭与转移的影响.方法 设计2条shRNA干扰载体及1条阴性对照载体,分别稳定转染乳腺癌MDA-MB-231细胞.用Western blot法筛选抑制效率高的细胞进行细胞平板集落形成实验、细胞黏附实验、细胞迁移及侵袭实验,观察COL1A1基因对MDA-MB-231细胞黏附、运动及侵袭能力的影响.结果 转染pshRNA-COL1A1-2干扰载体的MDA-MB-231细胞COL1A1蛋白表达降低明显,抑制率达66.98％±2.08％,选择该组细胞作为有效干扰组进行后续实验.pshRNA-COL1A1转染组细胞的集落形成率显著低于空白对照组和阴性质粒pshRNA-scramble转染组(P＜0.05)；细胞黏附实验中pshRNA-COL1A1转染组细胞的吸光度值较对照组明显降低(P＜0.001)；转染pshRNA-COL1A1质粒组细胞的穿膜细胞数也显著低于空白对照组和阴性质粒pshRNA-scramble转染组(P ＜0.001).结论 COL1A1基因沉默可在体外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的黏附、侵袭和迁移.
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利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应
目的 利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA (shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率.方法 分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒；将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组；将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度.病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定.结果 成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttlescramble和AD-shuttle).经过HEK 293细胞包装,终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011.NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100％；且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P＜0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P＜0.01).结论 携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默.
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shRNAs对胃癌细胞系BGC-823胃泌素表达的抑制效应
目的 研究shRNAs对胃癌细胞系BGC-823胃泌素表达的抑制效应.方法 设计4条针对胃泌素基因不同位点的寡核苷酸序列,通过体外转录法合成相应的shRNAs.以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L和80nmol/L的终浓度,将4条shRNAs分别转染胃癌细胞BGC-823.应用原位杂交及免疫细胞化学方法检测胃泌素表达的抑制效果,筛选有效的shRNA.应用RT-PCR进一步验证其对胃泌素mRNA的抑制效应.应用MTT法检测4条shRNAs在不同浓度下对BGC-823细胞的增殖抑制效应.结果 转染后24h、48h及72h,胃泌素表达均被明显地抑制,并呈现浓度及时间依赖的趋势.shRNA3转染后72h,mRNA及蛋白水平表现出佳的抑制效率,分别为(54.27±0.042)%和(41.69±0.038)%.RT-PCR结果显示,shRNA3对BGC-823细胞胃泌素mRNA的抑制率为48.1%.MTT结果显示,除shRNA4处理组外,其余3组处理细胞均表现出浓度依赖性的增殖抑制趋势.结论 4条shRNAs在mRNA及蛋白水平均明显地抑制了胃癌细胞BGC-823胃泌素的表达,shRNA3可能为有效的胃泌素-shRNA.shRNA对胃泌素表达的抑制,显著降低了BGC-823细胞增殖能力.
关键词： 胃泌素 shRNA 胃癌 原位杂交 逆转录-聚合酶链反应 -
shRNA干扰Rab9 GTPase表达对麻疹病毒野生株体外增殖的抑制作用
目的 构建Rab9 GTPase短发夹RNA(shRNA)表达载体,观察其对Rab9 GTPase基因表达和麻疹病毒野生株体外增殖的抑制作用. 方法 参照GenBank中Rab9 GTPase基因序列设计合成2对Rab9 GTPase基因特异性shRNA,定向克隆入表达载体,构建重组表达载体,酶切鉴定和序列分析证实后脂质体法转染U937细胞,然后感染麻疹病毒野生株,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western blot)检测转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平;标准蚀斑试验测定病毒滴度;流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化;RT-PCR检测转染细胞内双链RNA依赖蛋白激酶(PKR)和2'-5'寡腺甙酸合成酶(OAS-1)的mRNA水平. 结果 酶切和序列分析证实,成功构建了靶向Rab9 GTPase基因的shRNA表达载体.2个shRNAs均可特异性抑制U937细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达,高抑制率分别为(90.5±0.2)%和(92.1±0.3)%;蚀斑试验结果表明,shRNAs可以有效抑制麻疹病毒野生株体外增殖,其抑制率可达到90%以上;流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率无明显变化;RT-PCR检测PKR和OAS-1的mRNA水平转染前后无明显变化. 结论 成功构建Rab9 GTPase特异性shRNA表达载体.shRNAs通过特异性抑制Rab9 GTPase基因表达抑制麻疹病毒野生株体外增殖.
关键词： Rab9 GTPase shRNA 麻疹病毒野生株 增殖 -
靶向Rab9GTPase基因shRNA体外抑制麻疹病毒Edmonston株复制的研究
目的:构建靶向Rab9 GTPase基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,观察shRNA对Rab9 GTPase表达和麻疹病毒Edmonston株体外复制的抑制效应.方法:按照shRNA的设计要求和Rab9 GTPase基因序列构建靶向Rab9 GTPase基因shRNA表达载体,表达载体经酶切鉴定和序列分析后通过脂质体法转染Vero-E6细胞,然后感染麻疹病毒Edmonston株,通过RT-PCR和Western blot检测转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平;通过标准蚀斑试验检测病毒滴度,观察shRNA对麻疹病毒Edmonston株复制的抑制效应.结果:靶向Rab9 GTPase基因的shRNA可特异性抑制Vero-E6细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达,大抑制率分别为(86.3±0.7)%和(87.6±0.7)%;蚀斑试验检测Rab9 GTPase基因表达沉默后对麻疹病毒Edmonston株体外复制抑制率达90%以上,且抑制效应至少可持续32 d.结论:靶向Rab9 GTPase基因的shRNA能特异性抑制Rab9 GTPase表达和麻疹病毒Edmonston株体外复制,有望成为抗麻疹病毒感染治疗的核酸药物.
关键词： Rab9 GTPase shRNA 麻疹病毒Edmonston株 复制 -
RYBP基因沉默对HL-60细胞对化疗药物敏感性的影响
目的:用RNA干扰技术探讨白血病HL-60细胞株RYBP基因沉默后对化疗药物敏感性的影响.方法:构建针对RYBP基因的shRNA干扰质粒并建立稳定沉默RYBP基因的白血病HL-60细胞株,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测确认RYBP基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果.然后用DNA ladder及Annexin V标记的流式细胞术检测各组HL-60细胞凋亡的情况,用CCK-8法检测各组HL-60细胞对化疗药物阿糖胞苷和柔红霉素的敏感性.结果:成功构建的RYBP shRNA慢病毒载体能够有效沉默HL-60中RYBP基因的表达.在没有加入化疗药物时RYBP shRNA组凋亡率低于空载体对照组(NC组)(P＜0.05);用阿糖胞苷处理时RYBP shRNA组凋亡率和抑制率均低于NC组(P＜0.05);用柔红霉素处理时RYBP shRNA组凋亡率虽然低于NC组,但是抑制率差异不明显.结论:HL-60细胞RYBP基因沉默能抑制细胞的凋亡,明显降低对阿糖胞苷的敏感性,但是对柔红霉素敏感性的改变不明显.
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shRNA沉默NSD2基因表达对OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响
目的:探讨干扰shRNA下调NSD2基因表达对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响.方法:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞,应用real time Q-PCR检测NSD2mRNA的表达和Western blot法检测NSD2蛋白的表达,以鉴定NSD2 shRNA的沉默效果,应用CCK-8试验检测细胞增殖,AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot测定组蛋白H3K36二甲基化水平(H3 K36me2)、BAX BCL-2、caspase-3、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR (p-mTOR)、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶(phos-phorylation P70 ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)的变化.结果:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞72 h后,real time Q-PCR和Western blot检测显示NSD2的mRNA和蛋白表达均有明显下降(P＜0.05),NSD2 shRNA组细胞增殖率明显低于对照和Neg shRNA组(P＜0.05),NSD2 shRNA组细胞的凋亡率明显高于对照组和和NegshRNA组(30.37±4.22)％vs(1.36±0.52)％和(2.17±1.43)％(P ＜0.05);促凋亡蛋白BAX表达上调,抑制凋亡蛋白BCL-2表达下调,caspase-3表达上调;H3 K36me2水平较对照组明显下降,而检测Akt/mTOR通路蛋白发现,Akt总蛋白水平未明显下降,但是活性形式的磷酸化p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K表达下调.结论:干扰沉默NSD2基因可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是调节组蛋白H3 K36 me2水平变化,特异性地抑制Akt/mTOR信号通路的活性.
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β-catenin特异的shRNA干扰对K562细胞作用的初步研究
本研究在探讨β-联蛋白(β-catenin)序列特异的小发夹RNA(shRNA)干扰其表达后对K562细胞生长的影响.采用脂质体介导方法,将含编码β-联蛋白特异的shRNA的质粒转入K562细胞,经G418筛选提高细胞阳性率,用实时定量PCR和Western blot分别检测干扰后β-联蛋白转录水平及蛋白水平的表达变化,通过绘制生长曲线、MIT测定及集落培养等方法观察干扰后细胞生长能力的差别.结果发现:与对照组相比,转染后72小时干扰质粒可有效降低K562细胞β-联蛋白mRNA水平的表达(p＜0.05),但短期培养对蛋白水平的表达未发现明显影响.经G418长期筛选后,对照组可见细胞阳性率逐渐提高,并可筛选到几近100%阳性的细胞克隆,而干扰组细胞则逐渐死亡.在G418存在下,干扰组与对照组K562细胞短期增殖曲线及MIT结果显示两组间无明显差异,但集落培养发现,干扰组细胞无论集落形成率(p＜0.001)还是形成的集落大小均明显低于对照组,说明干扰质粒可影响细胞的集落形成能力.结论:β-联蛋白特异的shRNA干扰可以有效降低K562细胞中β-catenin基因的表达,降低细胞集落形成能力;K562细胞的生长依赖于β-联蛋白的存在,针对β-联蛋白的RN Ai治疗或其它靶向治疗可能对CML治疗有效.
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序列特异性短发夹状RNA逆转白血病多药耐药性研究
本研究旨在构建并筛选MDR1序列特异性短发夹状RNA干扰载体,研究其对K562/A02细胞的影响.采用脂质体介导方法,将含mdr1-shRNA质粒转入K562/A02细胞,经G418筛选得到稳定表达细胞株,用实时定量RT-PCR和Western blot分别检测干扰后mdr1 mRNA水平及蛋白水平的表达变化,通过CCK8测定干扰后细胞对化疗药的敏感性变化,Rhodamine123外排实验检测P-gp功能的变化.结果发现:与对照组相比,4种MDR1-shRNA栽体均能显著下调P-gp的表达,其中508-526靶位点的shRNA作用效果好.结论:筛选得到的MDR1-shRNA载体能够显著下调MDR1的表达,逆转耐药表型,为后续进行的动物实验研究创立了条件.
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GATA-1对高原红细胞增多症模型大鼠骨髓CD71+细胞EpoR表达的影响
目的:探讨GATA-1对高原红细胞增多症(high altitude polycythemia,HAPC)模型大鼠骨髓CD71+细胞促红细胞生成素受体(EpoR)表达的影响.方法:选用雄性SD大鼠48只,随机分为对照和HAPC模型2组.在海拔4 300米自然环境下复制HAPC模型并采用骨髓细胞分类计数和血液学参数检测进行验证.应用密度梯度离心和免疫磁珠分选相结合的方法分选大鼠骨髓CD71+细胞后,应用流式细胞术和细胞免疫荧光观察其EpoR的细胞表面表达水平,Q-PCR和Western blot检测其GATA-1、EpoR mRNA和蛋白的表达变化.分别在常氧和低氧下培养CD71+细胞,筛选佳干扰序列GATA-1 shRNA1后,转染96 h,Q-PCR和Western blot检测GATA-1、EpoR mR-NA和蛋白的表达水平.结果:血液学参数和骨髓细胞分类计数结果显示,HAPC大鼠模型复制成功.与对照组比较,HAPC模型组骨髓CD71+细胞膜表面EpoR的表达增高(P＜0.05),GATA-1、EpoR mRNA和蛋白的表达也明显增高(P＜0.05).相关性分析显示,两组GATA-1、EpoR mRNA和蛋白的表达均呈正相关(对照组,r=0.929,P＜0.01,r=0.802,P＜0.05;HAPC模型组,r=0.822,P＜0.05,r=0.839,P＜0.01).GATA-1 shRNA1干扰两组骨髓CD71+细胞96 h后,EpoR mRNA和蛋白的表达低于阴性对照组(P＜0.05),且在低氧条件下GATA-1和EpoR的表达仍高于相应的常氧状态.结论:GATA-1对EpoR表达的影响可能与HAPC的发生发展相关联.
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SDF-1α和c-MYC蛋白调控速激肽受体-1截短型mRNA表达的研究
目的 观察基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor 1α,SDF-1α)、c-MYC蛋白对速激肽受体-1截短型(tachykinin receptor 1 trucated,TACRI-Tr)转录水平的影响.方法 构建c-myc基因shRNA表达载体;用小干扰RNA方法沉默乳腺癌细胞MCF-7的c-myc基因,分成c-myc+细胞组和c-myc-细胞组,相关实验组加SDF-1α细胞因子中和抗体,用实时定量PCR检测TYACR1-Tr mRNA表达水平.结果 c-myc基因shRNA表达载体构建成功;在正常培养条件下,c-myc-细胞组的TACR1-Tr转录水平低于c-myc+细胞组(P<0.05);加了SDF-1α中和抗体后,c-myc-组TACR1-Tr的mRNA表达水平高于c-myc+组(P<0.05).结论 MCF-7细胞在正常培养条件下,c-MYC蛋白可以反式激活TACRI-Tr的转录;但加入SDF-1α因子中和抗体后,c-MYC蛋白失去了这种激活作用.
关键词： 基质细胞衍生因子1α 速激肽受体-1 shRNA c-myc基因 -
SNAP-23对NK细胞杀伤效应的调控
目的探讨SNAP-23对NK细胞杀伤效应的调控作用.方法通过核酸转染仪转染SNAP-23 shRNA(short hairpin RNA)质粒阻断NK92细胞中SNAP-23蛋白的表达,分别利用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验和β-己糖氨酶释放实验检测SNAP-23表达下降对NK细胞杀伤效应和胞吐效应的影响.结果核转染仪可将shRNA质粒成功转入NK92细胞,所设计的3条SNAP-23的shRNA能抑制SNAP-23的蛋白表达,继而导致NK92细胞的杀伤活性和胞吐效应下降.结论SNAP-23通过调控NK细胞的胞吐效应而参与NK细胞杀伤效应的调控.
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S6K1 shRNA基因重组腺病毒的构建及对基因沉默效果的研究
目的 构建S6K1 shRNA基因重组腺病毒(S6K1Ax)并在细胞及小鼠肝脏验证对S6K1基因的沉默效果.方法 设计3种S6K1 shRNA序列,通过在pcPUR质粒与pcDNA3.1质粒、cosmid质粒之间的拼接将S6K1 shRNA转染进腺病毒,筛选沉默效果佳的S6K1Ax并在293细胞扩增纯化得到高效价的S6K1Ax.感染来源于小鼠的肝脏、肌肉、脂肪细胞系,在Western blot水平评价其对S6K1蛋白表达的抑制效果.将S6K1Ax注射进C57BL/6J小鼠尾静脉,6 d后处死小鼠取肝脏,逆转录-聚合酶链反应和Western blot观察小鼠肝脏S6K1在mRNA和蛋白水平的表达.检测注射S6K1Ax前后小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)变化.结果 Western blot证实制备的S6K1 Ax可抑制来源于小鼠的肝脏、肌肉、脂肪3种细胞系和小鼠C57BL/6J肝脏S6K1的蛋白表达.小鼠肝脏S6K1 mRNA结果显示:对照组为1.39±0.21,实验组为0.63±0.09,t=6.132,P<0.01,差异有统计学意义.S6K1Ax注射小鼠,ALT水平注射前为(15.15±4.43)U/L,注射后为(17.32±4.22)U/L,t=1.451,P>0.05,差异没有统计学意义.结论 构建的S6K1Ax可将来源于小鼠的细胞系及C57BL/6J小鼠肝脏S6K1基因沉默,为研究S6K1的基因功能提供了适合的实验工具.
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靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定
目的构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶（ phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）基因的短发卡干扰RNA（short hair-pin RNA，shRNA）表达载体，研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用，探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段。方法根据Genbank中大鼠PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10，经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板；合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列，将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cb-shRNA上，构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22αp-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称SM22αe/p shRNA）和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称KDR e/p shRNA）；将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞，分别于转染24 h、48 h、72 h后，采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量。结果荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较，前者细胞Pik3cb mRNA相对表达量降低更为明显，且两组均较对照组mRNA表达明显减少（ P＜0.05）；酶切鉴定重组质粒载体SM22αe/p shRNA和KDR e/p shRNA构建成功；质粒转染细胞后，Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22αe/p质粒组较阴性对照组均有所降低，且转染24 h后，SM22αe/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低，差异均有统计学意义（ P＜0.05）。结论选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板，能够成功构建SM22αe/p shRNA和KDR e/p shRNA质粒载体，且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达。
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靶向SMAD3基因的shRNA重组慢病毒对大鼠肝再生的作用
目的:应用大鼠肝大部切除肝再生模型,将前期构建好的靶向SMAD3基因的shRNA重组慢病毒注射入大鼠体内,观察SMAD3 shRNA对大鼠肝再生的影响.方法:将60只♂Wistar大鼠随机分为3组:SMAD3 shRNA组(20只)、shRNA对照组(20只)、生理盐水对照组(20只),通过脾脏注射方法给药,慢病毒给药剂量为1.0×108 TU/只,生理盐水对照组给予等体积500 μL生理盐水.给药96 h后行2/3肝大部切除,构建大鼠肝再生模型;肝大部切除术后96 h各组分别除死大鼠7只,剩余大鼠于144 h处死,收集肝脏标本,Real-Time PCR、免疫组织化学检测肝组织SMAD3表达,免疫组织化学检测肝组织Ki67表达,测定大鼠肝质量/体质量,观察SMAD3shRNA对肝再生的影响.结果:Real-Time PCR检测显示,通过脾脏注射慢病毒,在96、144 h处死时间点,SMAD3shRNA组SMAD3 mRNA分别较shRNA对照组平均下降73％、63％.免疫组织化学检测显示SMAD3蛋白表达明显下降.Ki67免疫组织化学结果显示,肝大部切除术后96、144 h,SMAD3 shRNA组Ki67表达阳性细胞数均明显多于生理盐水对照组及shRNA对照组,表明抑制SMAD3表达后肝细胞增殖活跃.大鼠肝质量与体质量比值显示,SMAD3 shRNA组分别较生理盐水对照组及shRNA对照组有增加趋势(96 h:4.50±0.43 vs 3.97±0.55 vs 3.98±0.40,144 h:4.66±0.54 vs 4.15±0.51 vs4.20±0.34),但没有统计学意义(P＞0.05).结论:SMAD3 shRNA在大鼠体内可一定程度上促进肝细胞增殖,但对肝再生的促进作用尚弱.
