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结核分枝杆菌S1蛋白的原核表达条件优化
目的 对结核分枝杆菌S1蛋白的表达质粒进行表达条件优化.方法 将构建的表达质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,对细菌浓度、IPTG终浓度、诱导温度和诱导时间进行筛选,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测不同表达条件的细菌培养上清中目的蛋白的表达量.结果 SDS-PAGE检测中,在细菌浓度OD600为0.8,IPTG的终浓度为0.5 mM,诱导表达的温度为25℃,诱导16 h的条件下,S1蛋白的条带灰度值和相对占比为本体系下佳.结论 建立了S1蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达的佳条件.
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Klenow(exo-)的表达、活性测定及其在焦磷酸测序中的应用
野生的Klenow聚合酶具有3′-5′外切酶活性,会对引物进行切割而造成焦磷酸测序产生错误的延伸信号.为了制备缺失3′外切酶活性的Klenow聚合酶用于焦磷酸测序反应,该研究全合成了外切酶活性缺失突变的Klenow酶基因编码序列,将其插入到表达载体pET28a(+)中构建重组质粒,并转化到大肠杆菌中,表达外切酶活性缺失的Klenow酶(Klenow(exo-)).通过优化诱导温度、诱导时间与诱导剂浓度,得到了Klenow(exo-)的佳表达条件为30℃时诱导表达5h且IPTG浓度为0.1 mmol/L.利用Ni+柱亲和层析法纯化得到了相对分子质量约为67 000的重组Klenow(exo-)酶,并建立了基于生物发光的酶活测定方法,终将其用于焦磷酸测序反应.结果表明,制备的重组酶具有良好的聚合酶活性但缺失了3′外切酶活性,可成功测定DNA待测模板序列,为焦磷酸测序技术提供了一个有效的关键酶.
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弓形虫SAG2/GST融合蛋白在E.coli中的表达条件的研究与纯化
提高弓形虫SAG2/GST融合蛋白在在E.coli中的表达水平并纯化.对诱导温度、诱导物浓度与诱导时间等条件与目的蛋白在细菌裂解上清中的表达量的关系进行了研究.在表达条件优化后,大量制备目的蛋白利用GlutathioneSepharose 4B亲和层析进行初步纯化.纯化产物进一步切胶回收纯化.SAG2/GST融合蛋白在37℃,以0.2mMIPTG诱导4小时后在细菌裂解上清中的表达量高.SAG2/GST融合蛋白在亲和层析后得到初步纯化并在切胶回收后得到电泳纯的SAG2/GST融合蛋白.获得了SAG2/GST融合蛋白在E.coli的佳表达条件.得到了两种纯度的SAG2/GST融合蛋白.为进一步研制弓形虫重组抗原疫苗、弓形虫免疫诊断试剂及单克隆抗体提供了基础.
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破伤风毒素C片段(TTc)在大肠杆菌中的表达、优化与鉴定
HTSS以一株破伤风生产菌株基因组DNA为模板,通过上游引物中几个碱基的修改,PCR扩增出破伤风毒紊C片段(TTc)基因,构建了原核表达质粒pET-42(b)/TTc,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.重组蛋白分子量约50kD,表达量为22%,超声波破碎显示为可溶性重组蛋白.通过对培养基、诱导时间、诱导温度的优化,重组蛋白的表达量和可溶性均有提高.Western blotting检测表达产物可与破伤风C片段单克隆抗体产生特异的免疫反应.该工作为亚单位疫苗或载体蛋白的开发奠定了基础.
