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弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析
构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET 23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.成功构建了pET 23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.
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间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在E.coli中的融合表达
在大肠杆菌(E.coli)中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST-PvMSP1 C.方法:以限制性内切酶BamH Ⅰ和Sa1Ⅰ双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段,柱纯化后,插入表达质粒载体的多克隆位点,构建重组体pGEX-4T-2/PvMSP1C,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导表达,表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析.双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得1119bp的PvMSP1 C编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建的pGEX-4T-2/PvMSP1 C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE电泳显示,GST-PvMSP1 C融合表达蛋白的大小约63ku,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别.成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C端编码基因pGEX-4T-2/PvMSP1 C表达质粒,诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白,表达蛋白具有一定免疫活性.
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家蝇抗菌物质诱导研究
为探讨家蝇抗菌物质诱导表达的规律,选取室内饲养的家蝇第10代三龄幼虫,采用2号昆虫针针刺体壁,每虫1针,针刺处理后,分别于第0、24、48、72小时记录幼虫活率.剪头法提取上述不同时间的血淋巴,金黄色葡萄球菌为指示菌,采用平板滤纸片法作抑菌试验,用于显示家蝇抗菌物质的诱导表达,以抑菌圈直径表示抑菌活力的大小.提取家蝇诱导后48小时的血淋巴,设置不同的血淋巴加样量实验组,记录不同加样量对金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌的抑菌效果.
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猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化
目的优化猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗毕赤酵母表达系统.方法毕赤酵母转化菌在BMMY、BMM、MM及各加1%酪蛋白水解物(CA)的诱导培养基中经0.5%甲醇诱导表达后,上清液行SDS-PAGE.结果高拷贝毕赤酵母转化菌SMD1168的表达水平高于酵母转化菌GS115;Muts型比Mut+型表达量高;表达水平与拷贝数呈正相关,即拷贝数越高,表达量也越高;在诱导培养基BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基;阴性对照菌未见目的表达条带.结论猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化,为大量制备生产打下了基础.
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人肠三叶因子在pET系统中的表达、纯化及生物活性
目的 构建人肠三叶因子(hITF)原核表达载体,表达重组hITF,并考察其生物学活性.方法 通过RT-PCR获得hITF cDNA片段,将目的基因插入原核表达载体pET32a,得到重组载体pET32a-hITF,优化表达条件获得大表达产量,Ni-NTA亲和层析一步法纯化重组蛋白,SDS-PAGE、Western blotting及N端测序鉴定重组蛋白,细胞重建模型验证其功能.结果 经PCR及测序证实,hITF cDNA准确插入原核表达载体pET32a中,诱导表达后,SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为32kD,Western blotting分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性;N端15个氨基酸测序证明其序列正确性;体外实验证实其具有细胞促迁移能力.结论 成功构建出原核表达载体pET32a-hITF,获得重组hITF.
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成纤维细胞生长因子23蛋白原核表达及条件优化
目的 制备具有生物学活性的可溶性重组人成纤维细胞生长因子23(FGF23),并探讨其佳诱导表达条件.方法 克隆FGF23和SUMO-FGF23两个cDNA序列,分别与原核表达载体pET3c与pET22b相连,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)和BL21 (DE3)宿主菌中,对FGF23表达的佳质粒和宿主菌组合进行筛选,并对Rosetta (DE3)/pET22b-SUMO-FGF23重组菌株的佳诱导表达条件进行优化.结果 只有pET-SUMO-FGF23的质粒和Rosetta(DE3)的组合有FGF23蛋白质表达;融合蛋白在16℃、0.4 mmol/L IPTG诱导19 h以可溶形式表达,且上清表达量占菌体总蛋白的28％.结论 本研究成功获得了高表达量及可溶性的重组FGF23,佳表达条件是16℃、0.4 mmol/L IPTG诱导表达19 h.
关键词： 重组成纤维细胞因子23 原核构建 诱导表达 条件优化 -
单纯疱疹病毒-2型抗原gG-2在大肠埃希菌中的表达及纯化
目的 用基因工程方法表达单纯疱疹病毒-2型(HSV-2型)血清型特异性抗原,代替传统的病毒检测抗原.方法 采取PCR和蛋白质原核细胞表达方法.结果 成功地克隆出了HSV-2型特异性基因.采用该抗原包被试剂盒,能检测出生殖器疱疹感染者血清中的lgM抗体.结论 HSV-2型特异性抗原基因的成功表达,为HSV-2型感染者的特异性诊断和HSV-2型疫苗的研究打下基础.
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环氧化酶-2与肿瘤发生发展的相关性研究进展
环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是参与花生四烯酸的环氧酶代谢途径中的限速酶,可催化花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandins,PGs).已知哺乳动物的COX至少有两种异构酶COX-1和COX-2[1].COX-1、COX-2分别由Ptgs1、Ptgs2基因编码,具有不同的生物学功能[2].COX-1是一种结构型酶,在大多数组织中微量恒定表达,产生具有生理作用的前列腺素参与维持机体正常的生理功能. COX-2是一种诱导型酶,正常生理情况下除少数组织如前列腺、子宫等内有少量表达外,大多数组织中均不表达,但可被一些血管内外激活物如脂多糖、白介素-1、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血小板激活因子等诱导表达.COX-2具有两种酶的活性:一是环氧化酶的作用,将花生四烯酸转化为前列腺素G2(prostaglandinG2,PGG2);二是过氧化物酶的活性,将PGG2转化为前列腺素H2(prostaglandinH2,PGH2).研究发现COX-2还具有其他功能,COX-2水平上调伴有NF-κB激活,NF-κB激活后移位于细胞核内,诱导基因进行转录[3,4].近年来对COX-2的研究表明在一些肿瘤中存在COX-2过度表达现象,COX-2表达量为基础的20～80倍,而COX-1的表达量基本不变[5].提示COX-2可能与肿瘤的发生发展密切相关.现将COX-2与肿瘤发生发展的相关性研究进展综述如下.
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008 抗氧化剂和NFκB对大鼠肺微血管内皮细胞iNOS表达的影响
目的: 探讨NFκB以及抗氧化剂在大鼠肺微血管内皮细胞中对TNF-α加LPS诱导的iNOS基因表达的作用及其机制. 方法: 通过免疫组化染色ABC法用抗内皮细胞抗体CD31对培养的大鼠肺微血管内皮细胞进行鉴定. Griess法测定细胞培养上清液中的亚硝酸盐浓度以反映NO的生成. Northernblot结合RT-PCR分析iNOS mRNA水平. EMSA法测定细胞核内NFκB的结合活性. 结果: TNFα(100 U/ml)加LPS(1 ug/ml)处理内皮细胞2 h后iNOS mRNA水平明显上升(P<0.05), 24 h后能明显增加NO的生成(P<0.01). 用放线菌酮(10 mg/ml)或抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC, 0.1 mmol/L)或氮乙酰基半胱氨酸(N-acetylcystenine, NAC, 20 mmol/L)处理内皮细胞能降低TNF-α和LPS诱导的亚硝酸盐(NO)生成和iNOS mRNA表达(P<0.05). 抗氧化剂PDTC和NAC对NO诱导生成的抑制作用呈现剂量-效应关系. TNF-α(100 U/ml)加LPS(1 μg/ml)能刺激内皮细胞中NFκB的激活和转位. 当内皮细胞培养体系中加入PDTC(0.1 mmol/L)或NAC(20 mmol/L)1.5 h后这种激活作用被阻滞. 结论: ① TNF-α加LPS能够在转录或转录后水平诱导iNOS基因表达. ② TNF-α加LPS诱导的iNOS基因表达依赖于NFκB的激活. ③抗氧化剂能够通过抑制NFκB的激活来抑制iNOS基因的诱导表达.
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流感病毒ns1基因的克隆及其原核表达载体的构建
为了解H5N1亚型流感病毒株的ns1基因特性及其规模制备NS1蛋白,首先将病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增流感病毒全长ns基因.测序显示H5N1亚型流感病毒NS1 cDNA全长678bp,编码225个氨基酸.BLAST分析表明,Qa/ST/852/01(H5N1)病毒株ns1基因与近年来从华南地区分离的禽H5N1毒株的ns1基因有很高的同源性.之后采用PCR方法扩增ns1基因的cDNA片段,将其克隆到pGEX-4T-3载体中,与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因融合,构建重组质粒pGEX-4T-3/NS1 cDNA,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析,GST-NS1融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,并且以可溶形式存在,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的28.5%,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达96%以上.经免疫印记证实重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别.该表达载体的构建为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备提供了基础.
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应用bac-to-bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子蛋白
保守性多巴胺能神经营养因子(CDNF)是一类新型神经营养因子,可能对帕金森病(PD)具有一定的治疗作用[1-2].我们通过bac-to-bac杆状病毒表达系统,在sf9昆虫细胞中成功诱导表达出重组CDNF蛋白.
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胶质瘤单链抗体的基因构建及表达
单链抗体(ScFv)因其能较好地保持对抗原亲和活性,分子量小,穿透力强,抗原性弱,且易与效应分子相拼接,是构建免疫毒素和双功能抗体的较理想元件.我们在已克隆抗胶质瘤单抗SZ39重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的基础上,构建了抗人脑胶质瘤ScFv基因,并克隆于表达载体pGEX-5X-1,在大肠杆菌中诱导表达,现将结果报道如下.
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严重烧伤大鼠的内源性保护机制初探
严重烧伤后机体发生一系列炎症反应,同时激活细胞内源性保护机制,其中热休克反应(heat shock response,HSR)是重要的抗损伤机制.本研究中发现严重烧伤大鼠单核细胞中HSP70得到明显诱导表达:伤后12 h的Western-blot灰度扫描结果与正常对照组(0 h)比较:(5.23±0.31)vs(1.70±0.43)(P＜0.01),而HSF1基因表达上调.同时,采用博星基因芯片公司的含有8 000个基因的鼠cDNA芯片,观察了严重烧伤鼠单核细胞基因表达谱的改变,结果发现190个基因表达上调,其中包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-15、GM-CSF、iNOS、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和Kruppe1样因子4(KLF4)等促炎因子11个,有175个基因表达下调,其中包括IL-10、IL-4等抗炎因子2个.运用生物信息学方法对改变基因启动子区分析得出11个基因的启动子区包含至少一个完整热休克元件(HSE)序列(nGAAnnTTCn).这些结果提示,严重烧伤激活了机体的热休克保护机制,HSF1参与了多数炎症因子的表达调控.
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在原核细胞中重组人肝刺激因子的表达、纯化及其功能研究
目的肝刺激因子(hepatic stimulator substance, HSS)在肝细胞中含量甚微、纯化困难,至今未分离到理想的生化纯品.利用DNA重组技术,进行人肝刺激因子(human HSS, hHSS)基因原核表达研究.方法 hHSS基因片段经PstⅠ和NdeⅠ消化后,定向插入至pT7-7载体相应位点.转化感受态细菌DH5α,通过限制性酶切图谱分析及DNA测序反应鉴定hHSS基因.再将pT7-7-hHSS表达载体转化到BL21(DE3)中,以IPTG诱导hHSS表达,通过超滤膜及阴离子交换柱纯化,获得目的蛋白,经蛋白印迹杂交及蛋白质肽指纹图谱分析鉴定hHSS.重组hHSS作用于BEL-7402细胞,利用MTT法检测其促增殖作用.结果 pT7-7-hHSS正确地表达了hHSS,纯化的rhHSS具促增殖作用,并呈现剂量-效应关系.结论通过构建pT7-7-hHSS原核表达体系,能正确高效地表达hHSS,且具有生物学活性.
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微囊化和基因修饰的肝细胞移植--人肝再生增强因子(hALR)的原核表达、纯化及生物活性研究
目的:构建人肝再生增强因子原核融合表达载体,并对表达产物进行生物活性研究,从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据,并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础.方法:以pGEM-T-hALR为模板,应用PCR技术扩增出hALRcDNA,克隆入原核融合表达载体pGEX-4T-2,限制性内切酶酶切及测序证实序列正确;转化大肠杆菌JM109:挑取阳性克隆以IPTG诱导表达融合蛋白GST-hALR,融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后进行凝血酶酶切获得hALR单体;采用3H-thymidine渗入法检测hALR单体的生物学活性.结果:以pGEM-T-hALR为模板,行PCR扩增后,产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,可见380bp特异性条带,符合hALRcDNA阅读框架的大小.构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR,经限制性内切酶酶切分析,与理论值相符,测序证明序列正确,片段为正向插入.重组表达质粒转化人肠杆菌JM109.SDS-PAGE电泳分析显示重组菌在约41KD处出现一蛋白条带.纯化、酶切后融合蛋白前体谷胱甘肽S-转移酶约26KD,hALR约15KD.薄层扫描蛋白电泳结果表明,表达的融合蛋白占细菌可溶性蛋白总量的31%.纯化hALR加入原代鼠肝细胞、HepG2细胞培基,细胞DNA合成率较对照组均有显著提高(P＜0.01).结论:成功构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR,限制性内切酶酶切及序列测定证明载体插入正确,并成功转化大肠杆菌JM109得阳性克隆.采用含融合蛋白GST的原核表达载体pGEX-4T-2表达hALR,其突出优点在于表达产率高;重组蛋白主要以可溶形式存在于胞质中,融合蛋白的分离纯化筛单易行.纯化分离后所得hALR能刺激体外培养的原代鼠肝细胞、HepG2细胞DNA合成,具有生物活性.
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采用蛋白质工程技术将a B晶状体蛋白导入心肌细胞的初步研究
目的: 采用蛋白质工程技术将a B晶状体蛋白(a B-crystallin,a BC)导入心肌细胞,以深入研究其保护心肌缺血损伤的分子机理,并为将其应用于防治心肌缺血损伤奠定基础.方法: 将人a BC的全长cDNA基因克隆至具有细胞膜通透能力的膜移位序列(membrane-translocat ing sequence,MTS)的下游,构建含GST-MTS-a BC融合蛋白基因的原核表达质粒,转染大肠杆菌DH5a.经IPTG诱导表达后,裂解细菌,谷胱甘肽亲和层析分离纯化GST-MTS-a BC融合蛋白,采用Xa因子切除GST,纤维素-DEAE-52离子交换层析分离纯化MTS-a BC.在检测其分子伴娘活性的基础上,采用异硫氰荧光索(FITC)对MTS-a BC进行标记,加入新生大鼠心肌细胞培养基中,采用荧光显微镜观察其在心肌细胞中的分布.结果: 1.重组的GST-MST-a BC质粒经EcoRI酶切后,可见一4.9 kb的载体及690 bp的a BC基因插入片段 . 经测序证实,重组质粒中的GST-MTS-a BC融合蛋白的序列处于同一阅读框架.2.GST-MTS-a BC原核表达质粒导入DH5a,阳性克隆经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示50 kD的GST-MTS-a BC诱导表达带.用谷胱甘肽亲和层析能分离该诱导表达组分.分离的GST-MTS-a BC被Xa因子切成二段,其一为23 kD的MTS-a BC:另一为26 kD的GST.Western免疫印迹分析证实,GST-MTS- a BC及MTS-a BC均能为人a BC抗体识别.3.MTS-a BC能使变性聚集的肌动蛋白重新解聚,其分子伴娘功能与HSP25大小相当. F ITC标记的MTS-a BC能进入心肌细胞中,而同样标记的a BC及牛血清白蛋白(BSA)均不能进入细胞.讨论: 本研究将12个氨基酸残基组成的具有膜通透能力的MTS的碱基顺序与a BC的全长cD NA序列融合,在大肠杆菌中表达出了MTS-a BC.这种融合蛋白不但具有a BC的分子伴娘功能 , 而且能导入心肌细胞.结论: 1.克隆、表达并纯化了具有分子伴娘活性的MTS-a BC.借助MT S的介导作用,能将a BC导入心肌细跑.2. a BC导入心肌细胞的成功,为进一步研究其保护心肌缺血损伤的分子机理提供了研究工具,并为将其应用于防治心肌缺血损伤奠定了基础.
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EBV-LMP1通过NFκB介导的信号传导途径活化CyclinD1机制初探
目的:探讨EBV-LMP1促进细胞增殖,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制和EBV-LMP1通过NFκB介导的信号传导途径活化细胞周期重要正性调节因子CyclinD1表达的机制.方法:利用已建株的,LMP1表达受四环素衍生物强力霉素严密调控的pTet-on-LMP1-HNE2稳定鼻咽癌细胞系,用强力霉素诱导LMP1的表达,Western blotting从蛋白质水平分析LMP1诱导CyclinD1表达的表达动力学,包括时间效应及剂量效应,进一步在LMP1稳定表达的鼻咽癌细胞系CNE-LMP1中,用反义硫代磷酸化寡聚核苷酸分别从LMP1,NFκBp65及CyclinD1三个层次阻断,结合报导基因分析法分析从转录水平阻断后,CyclinD1报导基因强度的差异,结合流式细胞仪分析这三个层次的阻断对细胞周期产生的影响,从而探讨在鼻咽癌中,EVB-LMP1促进CyclinD1表达的机制.结果:在pTet-on-LMP1-HNE2细胞中,Western blotting方法显示,较未经诱导比较,随着LMP1的诱导表达,CyclinD1的表达明显增强,且表达具有时间依赖性,但是剂量诱导表达效果不显著.在CNE-LMP1细胞系中,导入LMP1、p65及CyclinD1的反义寡聚核苷酸从三个层次分别阻断各自的表达后,报导基因分析结果显示,CyclinD1的报告基因活性均被抑制,分别下降7.1倍,13.7倍,及35.7倍,流式细胞仪分析结果显示,较之未处理的CNE-LMP1细胞,反义LMP1、P65及CyclinD1均可抑制细胞进入增殖期,分别抑制了35%,26%及7%.结论:EBV-LMP1可能经NF-κΒ介导的信号传导途径活化CyclinD1表达,导致细胞周期紊乱,进而赋于鼻咽癌细胞恶性增殖特性.通过本研究将信号传导与细胞周期这两个当前活跃的研究领域交叉起来,为阐明EB病毒致瘤机制开辟了一个新的视野.
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β5整合素在造血细胞上的表达及其与细胞增殖和诱导凋亡的作用
目的:整合素(integrins)是一类广泛存在于细胞表面的糖蛋白.在造血细胞的整合素由α和β两个亚基组成,参与细胞与胞外基质、细胞骨架的莲接,并通过酪氨酸和丝氨酸蛋白激酶系统介导细胞信息的传递.αvβ5的过度表达与肿瘤转移及血管形成有关.αvβ3也已证实与血管形成时的能动性调节及肿瘤的转移有关.αvβ3和αvβ5均可作用在摄取腺病毒易感的细胞,因而αvβ3和αvβ5的上调可引起腺病毒与易感细胞再结合增加.为研究αvβ5的功能及其对血源性细胞的作用,我们成功的构建了逆转录病毒载体系统和四环素控制下的诱导表达载体系统,并研究其对造血细胞整合素表达时细胞凋亡和增殖的影响;方法:用去除血清的方法,观察血源性细胞凋亡和分化时αvβ5和αvβ3的变化;用抗αvβ5单克隆抗体封闭血源性细胞上的αvβ5时,观察它们对凋亡和增殖的影响.结果和结论:用pGβ5CHT载体转导造血细胞,β5 cDNA未得到表达,用无血清培养诱导血源性细胞分化和凋亡时,αvβ5和αvβ3发生不平衡表达,αvβ5表达升高,αvβ3表达下降,与有血清培养相比,αvβ5和αvβ3比例是增加的,与K562相比,αvβ5对αvβ3的比例从有血清1.146升到无血清1.370,BV173细胞从0.147到0.464,U937从0.188到0.370,HL60从0.220到0.610,这些结果提示αvβ5的表达增加可促进无血清培养细胞的凋亡;用抗αvβ5单抗隆抗体封闭U937细胞,发现U937细胞的磷脂酰丝氨酸密度显著下降,这提示封闭细胞表面αvβ5可抑制细胞无血清引起的细胞凋亡;K562细胞β5表达水平的增加可抑制细胞的增殖.通过对β5反义转录单位的诱导表达研究发现,四环素可阻止tet/vp 16调控的反义β5基因的表达,从而导致外源性和内源性β5基因的表达,β5基因表达的提高可抑制细胞增殖,因而反义β5表达的缺乏与β5表达水平的增加及细胞生长抑制有关.
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钩体内鞭毛蛋白基因重组质粒的构建、表达和免疫保护性研究
对钩端螺旋体病的有效预防亟需广谱、高效、安全、价廉的疫苗.为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原,以探讨制备新疫苗的途径,我们设计一对引物(P1=5'-GCC GTC GAC ATG ATT ATC AAT-3',P2=5'-GGC TAG CTA TTA GAT ATG CTG CAG-3'),以赖型017株钩体DNA为模板,利用PCR扩增其编码基因完整的开放阅读框架,扩增产物经Sal I、Cla I双酶切消化后定向克隆于pT7-7载体上,构建原核表达重组质粒pLF2.将该质粒转化入大肠杆菌JM109(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示此产物相对分子量为34 kd.
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结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究
目的:结核病疫情再度增高给结核病的防治提出了新的挑战,由于卡介苗对结核病的预防效果极不稳定,发展新型结核病疫苗势在必行,本研究通过对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行克隆与表达研究,旨在为结核病新型疫苗研制提供新的靶点.方法:根据结核杆菌H37Rv株免疫保护性抗原Ag85A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物,以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板通过PCR扩增获得具有完整开架读码框(ORF)的Ag85A抗原基因,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体pBKCMV构建重组质粒,重组质粒转入大肠杆菌后IPTG诱导表达,并对其表达产物进行Western-blotting分析.结果:①PCR扩增获得了具有完整开架读码框的Ag85A抗原基因;②构建了Ag85A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体;③Ag85A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达.结论:本研究成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.
