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地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应
为了检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应.我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组pcDNA-L1,转染Cos-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.
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双功能融合基因在肝癌细胞中的表达与作用
目的:构建含有融合基因FCUl的自杀基因系统,观察其对体外培养肝癌细胞的杀伤效应.方法:将FCUl基因亚克隆于pEGFP-C1载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性重组子转染肝癌细胞HepG2,绿色荧光蛋白检测FCUl的表达,用G418筛选出阳性细胞克隆后,进行体外药物敏感实验,观察旁观者效应.结果:FCUl基因正确插入到pEGFP-C1中,pEGFP-FCUl转染成功的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,在5-FC作用下细胞的生长抑制率明显高于未转染细胞,且旁观者效应显著.结论:本基因治疗体系具有很好的体外杀肿瘤效果,为肝癌的基因治疗提供了一个新的选择.
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PC12-Mint2基因工程细胞株的构建
目的:构建稳定表达Mint2蛋白的PC12-Mint2基因工程细胞株.方法:用PCR方法将Mint2基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1A,构建真核表达质粒pcDNA3.1A-Mint2;采用脂质体Lipofectamine2000介导,将重组载体转染入PC12细胞,G418筛选抗性克隆,有血清培养并传代具有G418抗性的细胞,数代培养后获得工程细胞株;分别提取野生型PC12细胞和PC12-Mint2工程细胞的mRNA及细胞裂解液,RT-PCR方法检测Mint2基因是否整合入PC12细胞基因组,并用Western印迹法检测外源基因Mint2在PC12-Mint2工程细胞中是否正常表达.结果:扩增出的基因片段大小为2 253 bp;pcDNA3.1A-Mint2重组质粒酶切结果表明Mint2基因正确地插入到pcDNA3.1A载体中,测序结果正确;将pcDNA3.1A-Mint2转染PC12细胞,经G418筛选获得PC12-Mint2工程细胞株;RT-PCR结果表明Mint2基因已整合入PC12细胞,Western印迹结果显示在120 000处有特异条带,大小与Mint2蛋白理论计算值一致,表明在PC12-Mint2基因工程细胞中确实有Mint2蛋白表达.结论:本试验成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-Mint2,并获得了稳定表达Mint2蛋白的PC12-Mint2基因工程细胞株,为进一步研究Mint2生物学功能及其作用机制奠定了基础.
关键词: 基因亚克隆 Mint2 PC12细胞 转染 Western印迹法 -
间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在E.coli中的融合表达
在大肠杆菌(E.coli)中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST-PvMSP1 C.方法:以限制性内切酶BamH Ⅰ和Sa1Ⅰ双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段,柱纯化后,插入表达质粒载体的多克隆位点,构建重组体pGEX-4T-2/PvMSP1C,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导表达,表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析.双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得1119bp的PvMSP1 C编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建的pGEX-4T-2/PvMSP1 C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE电泳显示,GST-PvMSP1 C融合表达蛋白的大小约63ku,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别.成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C端编码基因pGEX-4T-2/PvMSP1 C表达质粒,诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白,表达蛋白具有一定免疫活性.