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检测肠产毒性大肠埃希菌GM1-ELISA方法的建立
肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)是重要的致病因子不耐热肠毒素(LT),由一个具有5-腺苷二磷酸二钠盐(ADP)糖基化活性的A亚单位(LTA)和神经结苷脂(GM1)有特异性高亲和力的B亚单位(LTB)构成.
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含扩增内对照的霍乱毒素基因ctx和不耐热肠毒素基因elt三重real-time PCR检测体系的建立
目的:建立一个含扩增内对照(IAC)的三重TaqMan real-time PCR体系,以检测霍乱毒素基因ctxA和肠产毒性大肠埃希菌的不耐热肠毒素基因elt。方法针对ctxA、elt和IAC设计引物和探针,进行灵敏性和特异性分析,评价三重反应之间的互相影响。结果该检测体系灵敏度为ctxA每个反应94拷贝,elt每个反应79拷贝,扩增效率分别为94.7%与98.1%。ctxA与elt拷贝数比例为1∶1~1∶10时,二者均能良好扩增;elt或ctxA的量是IAC的100倍以上时,IAC扩增受到抑制。结论该检测体系具有良好的灵敏性和特异性,可以用于腹泻粪便中感染病原菌的检测,其中内对照检测可以提示粪便样本中是否存在PCR抑制因子。
关键词: 霍乱毒素 不耐热肠毒素 实时荧光定量聚合酶链式反应 -
产毒性大肠杆菌肠毒素对豚鼠回肠上皮细胞的影响
产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起人和家畜急性腹泻病的主要病原菌之一[1].ETEC的致病主要与肠毒素有关.它能产生两类肠毒素:不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)和耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST).为进一步探讨ETEC肠毒素的作用机制,本研究观察了LT和ST对豚鼠离体回肠上皮细胞的影响.
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重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系.接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市.Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(HpaA)几乎存在于所有Hp临床菌株表面,高度保守且抗原性强.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及其A亚单位的突变体(LTKA63)和霍乱肠毒素B亚单位(CTB)有较强的免疫佐剂作用.
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黏膜传递系统和黏膜佐剂研究进展
黏膜传递系统和佐剂被认为是疫苗的重要组成部分.多年来,这一领域的研究不断深化,包括作为传递系统的重组减毒活细菌或病毒、质粒DNA、脂质体,以及霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素等传统的黏膜佐剂.但由于这些物质存在着毒副作用等局限性,新的更加有效和安全、经济的黏膜传递系统和佐剂一直是人们探索的目标.本文拟对一些近年有关菌影、芽孢等新的黏膜传递系统以及ADP核糖基化肠毒素类佐剂及单磷酰脂质A、CpG-ODN等佐剂新的进展简介如下.
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应用增强化学发光法分型检测肠毒素大肠埃希菌
肠毒素大肠埃希菌(ETEC)是引起人畜急性感染性腹泻的重要病原体.与人类腹泻密切相关的是不耐热肠毒素h(LTh)、耐热肠毒素Ⅰb(STⅠb)及耐热肠毒素Ⅰa(STⅠa)三种肠毒素菌株.我们利用一种新型的核酸探针标记和检测技术,建立了用辣根过氧化物酶(HRP)标记ETEC三种基因探针及通过增强化学发光法检测三种肠毒素基因并分型的方法,取得较好结果.
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幽门螺杆菌HspA与大肠杆菌LTB基因融合及表达
目的:构建和表达人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A亚单位(HspA)与E. coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.方法:采用PCR技术从人H pylori染色体DNA中扩增出354 bp的HspA基因,并克隆至pPLtB载体中与1tB基因融合,形成含有1tB-H spA融合基因的原核表达载体pPLH,并在工程菌E.coli JM109中诱导表达.结果:经序列分析,1tB-HspA融合基因由684个碱基组成,为编码228个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Westernblotting检测发现,融合蛋白的Mr 25×103,并与Hpylori感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示融合蛋白中存在LTB组分,并保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论:LTB-HspA融合蛋白有可能用于Hpylori基因工程疫苗的研究.
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新生儿大肠埃希菌感染的毒力因子基因检测研究
大肠埃希菌常在新生儿患者的血液甚至脑脊液和痰中分离到.为探索大肠埃希菌肠外感染的致病因素, 2003年6月,我们对2001年2月~2003年2月,我们对从12例新生儿患儿临床标本分离的13株大肠埃希菌进行了毒力因子志贺样毒素 (VT1、VT2、VT2e)、细胞坏死因子(CNF1、CNF2)、不耐热肠毒素(LT1)、耐热肠毒素(ST1、ST2)、肠侵袭因子(Einv)、肠聚集因子(Eagg)、A/E损伤因子(eaeA)基因检测,现报告如下:
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新型粘膜免疫佐剂候选株LTAˉB+的构建
目的:产肠毒素大肠杆菌产生的不耐热肠毒素(LT)不仅是很强的口服免疫原,而且其粘膜免疫佐剂作用显著.LT的毒性限制了它的直接使用,希望通过体外定点诱变技术,获得具有粘膜免疫佐剂作用的LT减毒株.方法:以人源LT基因为研究对象,首先构建了重组质粒pUC19-LT,然后用单引物PCR法和重叠延伸PCR法分别构建了LT Q7和K63基因突变体.结果:CHO细胞体外试验和家兔肠结扎体内试验毒性测定的结果表明,LT突变体K63的毒性明显降低.结论:K63有希望成为候选的高效粘膜免疫佐剂.
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经皮接种大肠杆菌不耐热肠毒素可预防旅行者腹泻
肠毒性大肠杆菌(ETEC)是引起旅行者及发展中国家婴幼儿腹泻的主要病因之一,每年约有2700万旅行者和2.1亿婴幼儿发生急性腹泻,其中约有38万婴幼儿直接死于该病.
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肠毒素大肠埃希菌定时定量PCR法检测
肠产毒素菌大肠埃希菌(ETEC)是引起腹泻的重要病原之一,患者除腹泻也可呈轻度水泻或严重的霍乱样症状.ETEC中的肠毒素可分为不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)[1].目前检测肠毒素ETEC的方法主要有动物试验、组织培养和免疫学方法等,这些方法检测周期长,操作繁杂,灵敏度不高[2].一般PCR方法虽然操作简便、快速、特异性较强,但存在假阳性、灵敏度不高等问题.基因芯片、蛋白质芯片检测ETEC的技术刚起步,且成本较高[3,4].而荧光标记的定量PCR方法,既克服了一般PCR检测方法假阳性、灵敏度不高的问题,还可以对微生物进行定量检测[5].本文应用定时定量PCR方法,建立ETEC的LT毒素标准曲线,获得较为理想的结果.现将结果报告如下.
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空肠弯曲菌PEB1-LTB DNA疫苗构建及其对小鼠免疫保护性的研究
目的 研究粘膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)辅助的空肠弯曲菌(C.jejuni)外膜蛋白PEB1基因重组DNA疫苗诱导小鼠免疫应答水平.方法 构建pcDNA3.1(-)-PEB1-LTB真核重组表达载体,转染Hela细胞,Western blot鉴定蛋白表达.滴鼻免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,测定小鼠血清中IgG、IgA及气管、小肠粘膜冲洗液sIgA抗体;脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4水平.末次免疫后4周,采用空肠弯曲菌重复攻击的方式进行灌胃攻击,攻击后,根据动物疾病指数评价疫苗临床保护率.结果 构建的重组表达质粒能在Hela细胞内表达,重组蛋白.疫苗免疫小鼠后,不仅诱导了高水平血清IgG、IgA抗体,而且诱导了高水平粘膜sIgA抗体.其诱导的特异性免疫应答能有效保护免疫后小鼠免遭空肠弯曲菌的感染攻击.结论 构建的DNA疫苗经粘膜免疫能诱导小鼠产生较高水平的特异性免疫应答,能有效预防空肠弯曲菌感染.
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幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB融合蛋白的表达及生物活性研究
目的通过基因工程方法构建并表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)以基因形式的融合蛋白,并对其生物活性进行初步研究,为幽门螺杆菌疫苗的研究奠定基础.方法用PCR方法从本室构建的融合基因克隆载体扩增出融合基因2 040bp的片段,将融合基因插入原核表达载体pET-11-c中.结果经全自动测序仪测序,SDS-PAGE和免疫印迹以及N端氨基酸测序分析,证实融合蛋白已在BL21中表达,初步纯化后通过动物实验和酶联免疫吸附试验证实其相应的免疫原性和免疫反应性,以及其中LTB成分和GM1结合的特性.结论融合蛋白表达方式为幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗的研究奠定了基础.
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CpG ODN、氢氧化铝和大肠埃希菌不耐热肠毒素无毒突变体联合佐剂对猪轮状病毒△VP8*亚蛋白免疫效果的影响
目的 评价CpG ODN、氢氧化铝[Al(OH)3]和大肠埃希菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)无毒突变体联合佐剂对猪轮状病毒(porcine rotavirus,PRV)△VP8*亚蛋白免疫效果的影响.方法 将LT A亚基上63位丝氨酸突变为赖氨酸,构建LT的无毒突变体重组表达质粒pET-30a(+)-LTK63,于E.coli表达重组蛋白LTK63,并进行纯化.将小鼠随机分为LTK63+ Al(OH)3组、CpG ODN+ Al(OH)3组、CpG ODN+ LTK63+ Al(OH)3组及Al(OH)3对照组,将P2-SB-1A △VP8*抗原蛋白分别与各组相应佐剂共同免疫小鼠,均经颈部皮下注射,隔2周免疫1次,共3次,于每次免疫后14 d采血,分离血清,间接ELISA法检测血清抗体效价及IgG亚型;末次免疫2周后,MTT法检测小鼠特异性淋巴细胞的增殖.结果 经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-30a(+)-LTK63构建正确;表达和纯化产物经SDS-PAGE及Western blot分析,均可见相对分子质量约33 000(A亚基)和13 000(B亚基)的目的蛋白条带.二免后,CpG ODN+ LTK63+ Al(OH)3组的抗体滴度显著高于LTK63+ Al(OH)3组、CpG ODN+ Al(OH)3组和Al(OH)3对照组(P< 0.05);末次免疫后2周,CpG ODN+ Al(OH)3组抗体滴度显著高于Al(OH)3对照组、CpG ODN+ LTK63+Al(OH)3组和LTK63+ Al(OH)3组(P<0.001);CpG ODN+ LTK63+Al(OH)3和LTK63+ Al(OH)3组小鼠血清中IgG2a和IgG1水平相当,CpG ODN+ Al(OH)3组血清抗体以IgG2a为主,Al(OH)3对照组血清IgG以IgG1为主;CpGODN+ Al(OH)3组小鼠特异性淋巴细胞的增殖能力强.结论 CpG ODN+Al(OH)3联合佐剂表现出明显的协同效应,可显著提高小鼠对PRV△VP8*亚蛋白的体液免疫和细胞免疫应答.
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Hib-CRM197多糖结合疫苗经皮免疫诱导的抗Hib抗体应答
经皮免疫(TCI)是一种新型免疫方法,英国国立生物制品标准和控制研究所Mawas等检测了TCI b型流感杆菌(Hib)-白喉毒素(DT)交叉反应物质(CRM197)多糖结合疫苗加霍乱毒素(CT)或大肠杆菌不耐热肠毒素突变体(LTK63和LTR72)诱导的抗Hib和DT抗体应答.
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志贺菌减毒疫苗株表达的4型产肠毒素性大肠杆菌菌毛和不耐热肠毒素突变体诱导的免疫应答
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大肠杆菌不耐热肠毒素突变体LTR72增进肽抗原诱生CD4+T细胞和分泌γ干扰素的能力
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005 定居因子和不耐热肠毒素经皮免疫诱导抗ETEC的保护性免疫
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032 鼻内接种肺炎球菌多糖结合疫苗后的抗体应答鉴定及不耐热肠毒素对IgG亚类的影响
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038 以CpG DNA和/或大肠杆菌不耐热肠毒素突变体为佐剂粘膜免疫小鼠