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以PCR为基础的结核分支杆菌DNA分型技术及其应用
1998年结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组测序工作宣告完成,这就为建立分子生物学方法鉴定结核分枝杆菌并对其分型提供了更有力的依据.H37Rv整个基因组由4,411,529对碱基组成,含有约4000个基因,整个基因组内有56个区与插入序列(ISs)同源[1].
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用随意扩增多态性DNA PCR方法检查实验小鼠的嗜肺性巴氏杆菌
嗜肺性巴氏杆菌是动物致病菌,人感染多通过猫、狗咬伤或抓伤而致.嗜肺性巴氏杆菌是实验啮齿动物(特别是小、大鼠和豚鼠)巴氏杆菌病的主要病原菌.为了鉴定从实验小鼠分离的15株嗜肺性巴氏杆菌的基因型,本文用3个随机引物(每个引物不得由0个碱基组成),用RAPD-PCR方法对分离的15株嗜肺性巴氏杆菌进行扩增试验,以鉴定这15株嗜肺性巴氏杆菌的基因分型.本试验所用的15份测试菌株标本采自小白鼠,编号1~15号.24?h培养物离心沉淀,收集嗜肺性巴氏杆菌,细菌用PBS洗2次,再用单蒸水洗1次,沉淀物加0.7ml无菌水悬起,样品于100℃温度下加热煮沸5?min,迅速放冰水中冷却,直接用于PCR扩增,毋须提取DNA.3个随机引物的名称及碱基序列如下:OPL-7 5′AGG CGG GAA C-3′;ORL-11 5′ ACG ATG AGC C-3′;OPL-12 5′GGG CGG TAC C-3′,每次反应只用1个引物(图1).
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核苷酸衍生物相关技术在分子诊断中的应用与展望
近年来,一些人工合成的核苷酸衍生物,包括肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、锁核酸(locked nucleic acid,LNA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid,HNA)等开始在分子诊断领域中得以应用[1].与普通的核苷酸(DNA、RNA)一样,这些衍生物由A、T、C、G四种碱基组成,可通过碱基配对原则与互补的核酸序列结合.这些人工合成的核苷酸衍生物有诸多自身优势,如较高的热稳定性、酶抵抗性等.籍此,其可以明显改善普通分子生物学技术的性能特点,包括灵敏度、特异性、重复性等.譬如,利用3’端LNA修饰的引物可显著提高单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测的特异性,利用PNA夹止技术的抑制作用,可选择性扩增高野生背景中的少量突变[2,3].
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miR-126在冠心病中的研究进展
近年来,有关miRNA的研究已经成为生命科学领域中的研究热点并取得重要进展。miRNAs是一类广泛存在于动植物体内的非编码单链小分子RNA,由约21~26个碱基组成,具有高度的稳定性和进化保守性。miRNAs通过与特异性靶信使(mRNA)结合后在转录后水平抑制基因表达,在一定程度上调控细胞周期、生物体发育时序等,广泛参与动植物细胞分化、生长发育、增殖与凋亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程,具有极其重要的病理和生理意义。miR-126在人类心脏、内皮系统中高度表达,且在冠心病的发生、发展以及预测诊断方面起着极为重要的作用,本文就miR-126与冠心病的关系及其在冠心病中各方面的研究进展进行系统综述。
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幽门螺杆菌HspA与大肠杆菌LTB基因融合及表达
目的:构建和表达人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A亚单位(HspA)与E. coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.方法:采用PCR技术从人H pylori染色体DNA中扩增出354 bp的HspA基因,并克隆至pPLtB载体中与1tB基因融合,形成含有1tB-H spA融合基因的原核表达载体pPLH,并在工程菌E.coli JM109中诱导表达.结果:经序列分析,1tB-HspA融合基因由684个碱基组成,为编码228个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Westernblotting检测发现,融合蛋白的Mr 25×103,并与Hpylori感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示融合蛋白中存在LTB组分,并保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论:LTB-HspA融合蛋白有可能用于Hpylori基因工程疫苗的研究.
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基因测序让您走在疾病的前面
基因组测序测序你的基因很简单,只需要一点血液样本或者一些唾液.血细胞中的DNA带有人类完整的基因编码.DNA是由四种缩写为A、T、C、G的碱基组成,30亿个它们按特定的次序排列组合旋转形成了长长的双螺旋化学链条.基因组测序意味着弄清楚这些化学物质在链条里的排列顺序,所以基因组读起来仿佛一本书.
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尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR防污染中的应用
1.PCR"残留污染"在PCR操作过程中,容易出现"污染"问题,原因主要有如下几种情况:①模板的交叉污染:在样品采集或处理中,气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染,造成假阳性,属于正常DNA(由A、T、G、C四种碱基组成)引起的污染;②扩增产物的污染:在扩增过程中,将碱基T置换成U,使得扩增产物为U-DNA(由A、U、G、C四种碱基组成),由于产物量特别大,容易溢漏引起污染,造成假阳性;③核酸酶、蛋白酶的污染造成假阴性;在这三种情况中为严重是第二种,即称之为"残留污染",因为PCR扩增的放大倍数高达千万倍,而且在实际应用中扩增一直在反复进行,造成扩增产物的大量堆积,难于将其控制降解,即使是荧光PCR也很难避免扩增产物的污染,为了使得PCR结果更加可靠、准确,有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法,将操作过程中可能带入的残留污染物破坏,使其不能成为新一轮扩增的模板,从UDG的生物学性质可知,它是完成这一任务的佳选择.
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DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂与肿瘤不典型多药耐药
无论真核细胞还是原核细胞内的DNA分子,在细胞周期的G0和G1期主要以超螺旋形式存在,而在S、G2和M期,需要解开这种紧凑缠绕的DNA结构,以便DNA复制、转录、修复、重组、染色体分离等细胞生命活动得以顺利进行.DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase,Topo)可以催化DNA的超螺旋状态与解旋状态之间的相互转换,其中不发生碱基组成或顺序的任何变化.
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胰岛素生长因子-1与1型糖尿病的治疗
胰岛素生长因子-1(IGF-1)是由70个氨基酸碱基组成具有内分泌、自分泌及旁分泌特征的单链多肽,相对分子质量约为7 500,血液中IGF-1主要由人的肝细胞合成和释放.生长激素(GH)的主要效应是通过IGF-1 介导而起作用,在机体的生长发育中起重要作用,IGF-1 的结构和胰岛素有高度的同源性,故也有胰岛素样代谢效应.人重组IGF-1(rhIGF-1)可应用于动物实验和临床实验,为探索临床应用rhIGF-1 治疗糖尿病等疾病的可能性提供了理论的依据.
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乙型肝炎病毒基因分型及其意义
乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的公共卫生问题.据统计,全球约有20亿人和HBV有接触,并有3.5亿HBV感染者,其中四分之三感染者分布在亚洲.全球每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病,如肝硬化、肝癌等.HBV基因组为双链不完全环形DNA,全长由3 200个碱基组成,编码4个主要病毒蛋白--多聚酶(p)、X蛋白、包膜(S)和核心蛋白(C).HBV复制中有以mRNA为中间体的逆转录复制环节,由于这一过程缺乏校对酶的作用,容易发生碱基错误配对,因而HBV基因突变比一般DNA病毒频繁.以往人们认为宿主因素是决定不同临床表现的关键.近,HBV的自然变异及基因型的差别也成为研究的焦点之一.
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2'-O-methyl修饰的混合骨架反义基因应用进展
反义基因(antisense gene)一般由15~25个碱基组成,它是根据碱基互补原理,人工合成特定地与靶RNA或DNA序列互补、且经化学修饰的RNA片断,可以抑制或封闭靶基因表达.反义基因治疗主要方法:①抑制翻译:反义基因与mRNA起始部位发生结合,形成RNA(DNA):RNA二聚体.
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重组人β-防御素-2基因COS-7细胞的转染表达
目的:通过构建两种SV40系列的重组载体,即N端带Flag标签的重组hBD-2基因和C端带Myc和6xHis双标签的重组hBD-2,并转染COS-7细胞,探索建立既能持续有效地表达和分泌hBD-2、其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线.方法与结果:(1)将hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的上游带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,经DNA测序证明:hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(2)hBD-2全长cDNA片段插入编码双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+),构建出C端带Myc和6xHis双重标签的重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2.DNA测序结果表明:hBD-2cDNA片段插入方向和全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(3)采用脂质体转染法分别将以上两种重组真核表达载体导入COS-7细胞,分别从mRNA和蛋白质水平分析hBD-2的表达情况.并检测经重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染细胞的可溶性蛋白及其培养上清的抗菌活性.(4)采用RT-PCR法对经带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,结果扩增出一条约240 bp的cDNA片段,其大小与预测相符.经Western blot法检测到细胞可溶性蛋白在约10 kD处有强反应条带显示.(5)用特异性引物(hBD2p6/hBD2p7)对经pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染的COS7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,经Western blot法检测到细胞蛋白在约10 kD处有强反应条带显示,其大小与该重组质粒结构中由pCMV启动子驱动的基因片段有可能表达成肽链的分子量(10.1)相符.双层肉汤琼脂平板扩散法抑菌试验结果表明:分别与正常COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清比较,转染pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2的COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清在金黄色葡萄球菌质控菌株25 923的平板上形成明显的抑菌环.结论:(1)N端带Flag标签基因重组真核表达载体pCMV.tag2B/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法和Western blot法证实hBD-2基因已在COS-7细胞内持续有效地表达.(2)C端带双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法、Western blot法和体外抗菌实验证实,该系统不仅能有效地表达和分泌具抗菌活性hBD-2,也为其表达产物的检测、分离纯化提供了必要条件.
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β细胞素与2型糖尿病相关性研究
1 β细胞素的分子生物学特征β细胞素(Betacellulin,BTC)属于表皮生长因子家族,1993年首先由Shing[1]克隆成功.β细胞素的基因位于人类染色体的4q13±q21,DNA序列包括6个外显子和5个内含子,mRNA序列有1271个碱基组成.Sasada等[2]发现前体BTC是由178个氨基酸组成的,它包括许多区域如信号肽、短的前多肽;成熟BTC是由80个氨基酸组成的糖蛋白,分子量为32kD,主要包括表皮生长因子(EGF)的共有序列、膜外区、疏水跨膜区、胞浆区;BTCe,即BTC的EGF样结构,是β细胞素消化后的EGF样结构,是成熟BTC的后50个氨基酸,其促增殖作用与全长BTC无明显差异.整个BTCe结构被3个二硫键、1个疏水核和23个氢键来稳定.