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病毒样颗粒在免疫测定中的应用研究进展
检测病毒感染的免疫测定所用的抗原主要有灭活的病毒、具有病毒抗原表位的合成肽抗原以及利用基因重组技术构建和表达的重组蛋白.使用灭活病毒提取的抗原纯度相对较差,亦影响测定的特异性和灵敏性.许多病毒因不能人工培养或感染动物,或具有潜在的传染性和致病性,使得抗原的获得受到限制.
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幽门螺杆菌HspA与大肠杆菌LTB基因融合及表达
目的:构建和表达人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A亚单位(HspA)与E. coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.方法:采用PCR技术从人H pylori染色体DNA中扩增出354 bp的HspA基因,并克隆至pPLtB载体中与1tB基因融合,形成含有1tB-H spA融合基因的原核表达载体pPLH,并在工程菌E.coli JM109中诱导表达.结果:经序列分析,1tB-HspA融合基因由684个碱基组成,为编码228个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Westernblotting检测发现,融合蛋白的Mr 25×103,并与Hpylori感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示融合蛋白中存在LTB组分,并保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论:LTB-HspA融合蛋白有可能用于Hpylori基因工程疫苗的研究.
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抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达
目的构建抗人AFP 单链抗体(ScFv)的基因并转入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达.分离纯化ScFv并鉴定其生物活性.方法用RT-PCR方法从能分泌特异性抗人AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因.用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗人AFP单链抗体的基因.将ScFv基因克隆至pGEM-T载体构建,用限制性内切酶切以及测序鉴定.将ScFv基因连接到pET32 (a+)质粒,转化BL-21(DE3)细菌.抗性生长的克隆用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4 h.溶解细菌并纯化ScFv,通过SDS-PAGE电泳及竞争抑制ELISA实验检测其活性.结果获得的VH含339 bp,来自小鼠IgG γ链,VL含312 bp,来自小鼠κ链. VH和VL通过编码(G4S)3连接肽的45 bp序列连接在一起构成含696 bp的ScFv基因.BL-21(DE3)中表达的ScFv抗体与融合蛋白(TrxA)融合在一起并以包涵体的形式存在.TrxA-ScFv相对分子质量约40×103,ScFv相对分子质量约24×103.竞争ELISA实验显示:TrxA-ScFv可抑制41%的McAb与抗原结合,而ScFv抗体则可抑制53%的McAb与抗原结合.结论我们成功构建了由696个碱基组成的抗人AFP单链抗体的基因,并在大肠杆菌获得了高效表达.该单链抗体具有较高的抗原结合活性.