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人源抗Rh(D)单链抗体基因的克隆和表达
目的:构建人源抗红细胞Rh(D)抗原单链噬菌体抗体库.方法:应用噬菌体展示技术,从分泌抗Rh(D)抗体的细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,多次PCR扩增和克隆抗体可变区基因(VH/VLcDNA),经重叠延伸拼接(SOE)用编码连接肽(Gly4Ser)3的互补序列组成scFv基因,经酶切克隆入载体pCANTAB5E,使之呈现于噬菌体表面.使用完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,ELISA对所获抗体进行初步鉴定.结果:构建的噬菌体抗体库库容为1.2×107,噬菌体DNA中全长scFv基因的插入率为0.80,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为3×108pfu/m1的初级噬菌体抗体库.以完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,出现特异性富集.经Dot ELISA实验鉴定,得到1株与Rh+型红细胞特异结合的scFv噬菌体抗体.结论:运用噬菌体抗体库技术构建了人源抗红细胞Rh(D)抗原的噬菌体抗体库,为进一步对所获克隆株进行序列分析、可溶性抗体表达和纯化奠定了基础.
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单链抗体表达研究进展
单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成.在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物,将极大增强对靶细胞的杀伤能力.Kanter等[1]研究发现将个体基因型scFv和细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或免疫刺激肽组成融合蛋白,是一种有效治疗淋巴瘤的疫苗.Wang等[2]通过抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和抗单端孢霉毒素(ZEN)scFv基因融合.表达为抗DON和抗ZEN scFv,结果显示双功能抗体成功构建.并可应用于DON和ZEN检测.
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抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达
目的构建抗人AFP 单链抗体(ScFv)的基因并转入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达.分离纯化ScFv并鉴定其生物活性.方法用RT-PCR方法从能分泌特异性抗人AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因.用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗人AFP单链抗体的基因.将ScFv基因克隆至pGEM-T载体构建,用限制性内切酶切以及测序鉴定.将ScFv基因连接到pET32 (a+)质粒,转化BL-21(DE3)细菌.抗性生长的克隆用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4 h.溶解细菌并纯化ScFv,通过SDS-PAGE电泳及竞争抑制ELISA实验检测其活性.结果获得的VH含339 bp,来自小鼠IgG γ链,VL含312 bp,来自小鼠κ链. VH和VL通过编码(G4S)3连接肽的45 bp序列连接在一起构成含696 bp的ScFv基因.BL-21(DE3)中表达的ScFv抗体与融合蛋白(TrxA)融合在一起并以包涵体的形式存在.TrxA-ScFv相对分子质量约40×103,ScFv相对分子质量约24×103.竞争ELISA实验显示:TrxA-ScFv可抑制41%的McAb与抗原结合,而ScFv抗体则可抑制53%的McAb与抗原结合.结论我们成功构建了由696个碱基组成的抗人AFP单链抗体的基因,并在大肠杆菌获得了高效表达.该单链抗体具有较高的抗原结合活性.
