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1-14 低氧处理对肝癌细胞生长和NQ01酶活性的影响
目的研究低氧环境下肝癌细胞生长是否被抑制,胞内Ⅱ相解毒酶NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQ01)活性是否被诱导增高,以及二者之间的关系.方法肝癌细胞SMMC-7721接种于96孔培养板内,5%CO2孵箱培养24h后,换新鲜培养液(已用混合气预先平衡)放入低氧小罐,用5%CO2~95%N2混合气体进行缺氧处理(O2%<0.1%),分别培养6、9、12、24、36 h后,取出培养板,以MTT比色法检测细胞生长情况;NQ01酶活性采用微孔板直接测定法、细胞数用结晶紫染色法测定,NQ01酶活性结果表达为NQ01酶比活力(specifie activity)=A(NQ01酶活力)/B(细胞数).结果低氧处理6 h后细胞NQ01酶比活力较常氧对照组下降,而细胞生长加快.在9 h后,酶比活力呈现时效性升高,且低氧组酶比活力明显高于对照,而细胞生长则减慢(与常氧对照组比较均为P<0.01).将细胞生长曲线与酶活时间曲线作相关分析,统计学上差异无显著性.结论低氧处理在短时程内能够刺激肝癌细胞生长加快,抑制胞内NQ01酶活性;而超过这一时间段之后则使细胞生长减缓,诱导NQ01酶活性升高.
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慢性胆囊炎患者胆囊内Helicobacter pylori的细菌学特征
目的:探讨慢性胆囊炎患者胆囊内幽门螺杆菌(H pylori)的细菌学特征.方法:采集手术切除的病理确诊为慢性胆囊炎的新鲜胆囊标本黏膜刮片,接种于H pylori培养板,培养及鉴定后与胃中分离的菌株进行形态学、生化反应、免疫组化、PCR扩增、电镜观察等方面比较.结果:分离出3株细菌,经形态学观察、生化反应、抗Hpylori抗体免疫组化染色,Hpylori尿素酶A、B基因扩增及电镜观察证明他们是H pylori,与同一患者胃内Hpylori比较,除胆囊内H pylori尿素酶活性低于胃内Hpylori外,其他性质均相同.结论:推测胆囊内H pylori可能主要是通过胆道逆行感染进入胆囊.
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辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞p27蛋白表达的不同影响
目的:观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞(SPC)和内皮祖细胞(EPC)p27蛋白表达的影响,筛选新一代包被洗脱支架药物。
方法:采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞,将其接种在纤维连接素包被培养板,加入不同浓度辛伐他汀(0.01~10μmol/L)培养24 h后,平滑肌肌动脉蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,激光共聚焦显微镜鉴定FITC结合的植物凝集素(FITC-UEA-Ⅰ)和DiI结合的乙酰化低密度脂蛋白(Di I-acLDL)双染阳性细胞为正在分化的EPC, Western blot检测p27蛋白的表达。 -
肝素小分子片段对平滑肌细胞生长及其抗凝作用的对比研究
肝素小分子片段抑制平滑肌细胞(SMC)增殖及抗凝作用的关系目前尚缺乏认识。本研究发现几种小肝素片段抗凝活性基本丢失,但均保持了抑制SMC增殖的活性。 1. 材料与方法:(1)肝素及其小分子片段对培养的人主动脉SMC的作用:将培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC)接种于24孔培养板。每孔1 ml (1×104细胞),实验共分7组:第1~5组含有不同糖基数的肝素小分子片段,第 6组含大分子肝素,第7 组为对照组,不含肝素及肝素小分子片段。上述各组肝素的浓度均以糖醛酸表示,每组3个浓度(19、38、76 μg/ml)。用含 10%人血清,10%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h,然后用3[KG*2]HTdR参入法观察肝素及其小分子片段对培养的hASMC生长的影响。(2)肝素小分子片段抗凝活性的测定:用凝血法测定肝素及不同肝素小分子片段激活全血凝固时间。
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重组人表皮生长因子促进大鼠皮肤生长的作用及量效关系
选2日龄大鼠5只(军事医学科学院实验动物中心),处死后无菌操作剪下背部全层皮肤,刮除皮下组织,切成2×2mm方形皮块,接种到涂有胶原的24孔培养板内,每孔一块,贴附1h.孔内分别加入0.4ml含有五种不同浓度重组人表皮生长因子(rhEGF,军事医学科学院生物工程研究所)的15%小牛血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM),同时设不含rhEGF的对照,每组n=20.标本置5%CO2培养箱内培养(37℃),2d后换液,4d终止培养.皮肤用10%福尔马林固定,2%罗丹明耐尔蓝染色.将培养板倒置,覆以透明塑料膜沿皮肤生长后的边缘画线、剪膜,置分度值为0.1mg的分析天平称重.根据单位面积膜重量换算出皮肤生长后的面积.
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胃液对BIU-87细胞系细胞凋亡的影响
为探讨胃代膀胱术抑制膀胱肿瘤复发的机制,我们采用体外实验方法,观察胃液对膀胱癌细胞系BIU-87细胞凋亡的影响,报告如下。 材料与方法细胞培养及处理:将BIU-87细胞系置于37 ℃、5% CO2、含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养,待细胞生长旺盛、进入指数增殖期时,收获培养瓶中的细胞,调配成2.5×105个/ml细胞悬液,接种至预先置有玻片的24孔培养板和T-75培养瓶,实验各组分别加入胃液(终浓度7.6 μmol/ml)、稀盐酸(终浓度7.6 μmo l/ml)、阿霉素(终浓度2 μg/ml)和无药培养液,继续置于37 ℃、5%CO2条件下培养,24 h后收集细胞进行检测。
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膀胱癌化疗中纤维连接蛋白介导的药物耐受研究
纤维连接蛋白(FN)与肿瘤的浸润、生长、转移有密切的关系.Damiano等[1]发现,多发性骨髓瘤细胞粘附于包被FN的培养板后,对化疗药物的敏感性降低,将其称为细胞粘附介导的药物耐受(CAM-DR).我们的实验检测了膀胱肿瘤细胞与FN粘附后对化疗药物敏感性的变化.
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MTT比色法进行体外肿瘤药敏实验的影响因素
MTT法是建立于20世纪80年代初的一种测定细胞存活和增殖能力的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,其原理是黄色的MTT能被活细胞线粒体脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶)还原成蓝紫色的甲瓒(formazan),而死细胞和红细胞则无这种能力.后经不断改进,已被应用于生物学和医学的很多研究领域中,在肿瘤研究中的应用也日益广泛.由于MTT比色法简单、快速、灵敏,明显优于过去常用的染料排斥法,使用96孔培养板使得操作半自动化,可以在短时间内进行大量标本的测定,故对大量筛选抗肿瘤药物具有重要的意义,现已被广泛用于体外肿瘤药敏的测定.但MTT比色法也存在一些问题,在使用过程中会受到多种因素的干扰,现分析如下.
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抗生素杀菌滤液刺激全血产生肿瘤坏死因子、白介素6和白介素8的作用
1 材料与方法1.1 材料头孢三嗪(CRO)为上海新药业有限公司产品,亚胺培南(IMIP)为默沙东公司产品,庆大霉素(GEN)为烟台第二制药厂产品,氧氟沙星(OFX)为江西东亚药业有限责任公司产品.大肠埃希菌(ATCC 25922).肉汤培养基购于江苏宜兴万石培养基厂.组织培养板为丹麦NUNCION产品,微孔滤器购于上海医药工业研究所.
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瘤细胞转移能力分析的体外研究
RAB5A过表达与人肺腺癌转移相关[1].构建重组RAB5A正义真核表达载体和反义RNA[1-5]、转染AGZY()/( 83-9) 及Anip973细胞,发现RAB5A高表达在人肺腺癌细胞的转移表型和转移特性形成中有重要生物学作用.1 材料和方法1.1 细胞系标本 AGZY83-9 、Anip973、RAB5A-AGZY8-3 、Anip9731.2 主要仪器和试剂 (1)Transwell小室(USA);(2)12孔培养板(USA);(3)PVPF孔径12μm ;(4)FN.1.3 方法(1)涂趋化剂fibronectin 10μg于PVPF膜的下室面.(2)将膜用manicare固定于Transwell小室上,风干.(3)上室腔内加入2×105个瘤细胞,悬于0.1%BSA-RPMI1640培养液中.(4)将小室浸于R孔板的条件培养基上.37℃5%CO2温箱内孵育4h.(5)取出膜HE常规染色.(6)400倍光镜下计数,每组平行设3个滤膜.
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阴道毛滴虫培养板的临床应用评价
阴道毛滴虫病(Trichomonisis vaginalis)是一种由阴道毛滴虫(TV)引起的常见性传播疾病.其感染可造成阴道炎、男性不育症1等疾病,同时也是其它性传播疾病如艾滋病、梅毒的危险因素.2-4其诊断主要依靠实验室诊断,即找到TV病原体.目前实验室常用方法有镜检法、培养法、ELISA等多种方法,以培养法为TV检查的金标准.以上方法均存在一定缺陷,比如培养法检测时间长,操作不便;镜检法检测效能不高;ELISA、胶体金法等检测费用较贵.为快速准确检测阴道毛滴虫感染,我们开发了使用方便,检测效能高的阴道毛滴虫培养板(以下简称TV培养板),用于检测TV.现就TV培养板临床应用报道如下.
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护理托盘细菌污染情况调查
临床上使用护理托盘取送物品时,清洁、污染不分的现象较为普遍.为此,笔者对本院护理托盘(下简称托盘)污染情况进行了细菌学调查,为预防院内感染提供依据.报告如下.1 材料和方法1.1 收集各科室与供应室交换物品时所用的托盘31个(提篮19个,大方盘12个).用采样管中的无菌棉签在5 cm×5 cm规格板空心处作涂抹法采样.然后将已采样的棉签置入装有10 ml无菌生理盐水试管中,再用吸管吸取已经稀释并混合均匀的生理盐水0.5 ml,接种于普通营养琼脂平板上作倾注培养.随机抽取各科室托盘装置的、属有效期内的无菌包的外包布进行监测,采用直接压印法取样后,将培养板置入37℃恒温箱内培养24 h,计算菌落数.
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加热对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响
我们通过建立低转移潜能人肝癌细胞株MHCC97L[1]观察水浴加热对肝癌细胞体外增殖、侵袭运动能力的影响.一、材料与方法MHCC97L细胞培养瓶或培养板密封后浸没于42℃恒温水浴箱内加热,30min×2,间隔10min.
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外源性胃泌素在胃癌细胞增殖和凋亡中的作用
我们应用MKN45胃癌细胞株通过四唑蓝(MTT)比色分析法及流式细胞仪观察胃泌素在细胞增殖、凋亡中的作用,同时观察丙谷胺对胃泌素的拮抗作用,并与5-氟尿嘧啶(5-Fu)作比较,结果报道如下。 一、材料与方法 1.细胞培养:MKN45胃癌细胞株(上海市消化疾病研究所提供)培养于RPMI 1640培养液中,加入体积分数为10%小牛血清,置37 ℃5%CO2恒温培养箱,隔天换液,3 d传代。 2.试剂配制及实验分组:用5%的小牛血清的1640液将胃泌素(上海丽珠东风生物技术公司)配为25 mg/L浓度,丙谷胺(江苏金坛制药厂)浓度为32 mg/L,5-Fu浓度为10 mg/L。实验共分5组:空白对照组、胃泌素组、丙谷胺组、胃泌素+丙谷胺组和5-Fu组。 3.MTT比色分析法:取传代后72 h的细胞,用含10%小牛血清的培养液调整细胞浓度为1× 108个/L,接种于96孔培养板,每孔100 μl,待细胞贴壁后弃去培养液,空白对照组加5 %小牛血清培养液100 μl,胃泌素组加胃泌素液100 μl,丙谷胺组加丙谷胺液100 μl ,胃泌素+丙谷胺组二者各加50 μl。5-Fu组加5-Fu液100 μl,每组设8个复孔,培养72 h,结束培养前6 h加质量分数为5%MTT(Sigma公司)20 μl/孔,继续培养6 h,离心,弃上清,每孔加质量分数为20%十二烷基硫酸钠(SDS)100 μl,震荡5 min,室温30 min后,在酶标仪上测定570 nm波长处的吸光度值(A)。 4.流式细胞术:传代后72 h细胞用含体积分数为10%小牛血清培养液调整细胞浓度为1×10 9个/L,接种于6孔培养板,每孔1.2 ml,细胞贴壁后弃去培养液,空白对照组加5%小牛血清培养液2.0 ml,胃泌素组加胃泌素液2.0 ml,丙谷胺组加丙谷胺液2.0 ml,胃泌素+丙谷胺组二者各加1.0 ml。培养48 h后,分别收集每孔细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,2 ml 1640液制成细胞悬液,测定前离心弃上清,碘化丙啶(PI)染色,ANNEX IN-V(Boehringer mannheim公司)标记,测定凋亡细胞百分率。 5.统计学方法:两组间吸光度值采用t检验;凋亡百分率采用U检验。 二、结果 1.胃泌素对MKN45胃癌细胞的增殖作用:对照组吸光度A值为0.561±0.056;胃泌素组为0.767±0.065与对照组比较,MKN45增殖作用明显加快;丙谷胺组0.556±0.040与对照组间差异无显著性(P>0.05);胃泌素联合应用丙谷胺可抑制细胞的增殖[A值为0. 583±0.032,与胃泌素组比较,P<0.01,但不如5-Fu (0.453±0.045)强( P<0.01)]。 2.胃泌素对MKN45胃癌细胞凋亡的影响:胃泌素对MKN45细胞的凋亡有明显的抑制作用,胃泌素组细胞凋亡百分率仅为1.39%,明显低于对照组的9.58%(P<0.01),联合应用丙谷胺后凋亡增加(表1)。
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丙型肝炎病毒体外感染正常成人肝细胞的初步研究
一、资料与方法1.正常成人肝组织标本:取意外死亡的3例成年男性,1例成年女性肝脏,均无肝病史.临床生物化学和病理学检查无异常发现.各种肝炎病毒标志物检测均阴性.2.采用体外两步灌流法分离正常成人肝细胞.后用含10%小牛血清1640培养液按细胞密度1.0×106/ml稀释后接种至25 ml培养瓶和加爬片的24孔培养板.置于37℃、5%CO2培养箱孵育,2~3 d更换完全培养液1次,维持培养1月以上.
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淋巴细胞培养条件及常见失败原因探讨
淋巴细胞培养是实验研究常用的一项技术,对于培养器皿,可以选用培养板,培养瓶,培养皿,三角烧瓶,试管,青、链霉素小瓶等[1,2].目前,关于淋巴细胞分离方法的文献资料较多,论述较详细,而对淋巴细胞培养则论述较少,较简单.细胞培养工作十分繁琐,环节较多,探讨细胞培养的条件,对于成功培养细胞具有十分重要的意义.本文选用1.5ml离心管培养淋巴细胞,观察了淋巴细胞培养前后的变化,探讨了淋巴细胞培养的条件及失败的常见原因.现报道如下.
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呼伦贝尔地区蒙古族人群G1m(3)因子的频率分布调查
应用胶体金免疫层析一步法对呼伦贝尔地区蒙古族人群G1m(3)基因频率进行调查.1材料方法1.1血样由内蒙古呼伦贝尔市中心血站提供202名无血缘关系健康人的静脉血,滴加在96孔培养板的各孔内,置室温干燥后备检.