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运用实时荧光定量RT-PCR和ELISA方法定量检测SHIV的对比分析
目的 建立一种实时、灵敏、特异的针对人/猴免疫缺陷病毒(SHIV)的RNA载量检测方法,通过与酶联免疫吸附试验(ELISA)进行比较,成为监测SHIV病毒体外复制过程的常用方法.方法 体外转录制备RNA标准品,利用TaqMan EZ逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒的反应体系和针对SHIV gag保守区91个碱基的TaqMan探针与引物,建立一步法实时荧光定量RT-PCR.三种SHIV感染性分子克隆体外转染293T细胞,在不同的时间点采样,通过实时荧光定量RT-PCR和ELISA两种方法监测SHIV病毒复制过程.结果 两种方法监测的病毒复制过程基本一致,转染后2～48小时病毒复制出现明显的对数生长期,之后进入平台期,p24浓度大约103pg/ml,而RNA载量大约在108拷贝/ml.两者具有很好的相关性(r2＝0.834;P0.001).实时荧光定量RT-PCR灵敏度更高,检测范围更广,费用更低.结论 所建立的一步法检测SHIV病毒载量的实时荧光定量RT-PCR方法,可以作为监测SHIV体外扩增的常用方法.
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再生医学路还长
机体损伤和疾病康复过程中受损组织和器官的修复与重建,仍然是生物学和临床医学面临的重大难题.借助于现代科学技术的发展,如何使受损的组织器官获得完全再生,或在体外复制出所需要的组织或器官,进行替代性治疗便成为生物学、基础医学和临床医学关注的焦点.
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人类在五年内可以摆脱疾病吗?--谈科学与人文的关系
前不久,某报刊出了一个使笔者目瞪口呆的新闻:"人类五年内可以摆脱疾病."据报道,某集团的科学家向外界宣布:他们发现了一种全新的人体细胞--再生潜能细胞.在此基础上,已经完成了胃肠、骨髓、神经、胰腺、肾单位、胸腺、毛囊、肝脏等55个组织器官的人体原位或动物实验的体外复制,争取5年时间再完成人体或动物的其他151个组织器官的复制,实现人类206个组织器官的全部原位复制.
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PCR技术应用中的注意事项
PCR(聚合酶链反应)是美国petus公司的karymullis等人在1985年创建的核酸分析技术,近年来得到了飞速地发展.这一技术建立在DNA复制理论的基础上,用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段,其优点是无需进行克隆化即可有目的地扩增基因内某一特异的DNA片段.PCR反应包括3个过程:①变形,②退火,③延伸.PCR是模拟DNA体内复制过程,在DNA聚合酶的作用下,进行特定DNA的体外复制.PCR能将极微量DNA在体外扩增几百万倍,实际操作中稍有不慎就有可能出现假阴性或假阳性.因此在实际工作中一定要严格按照操作说明,尽量避免假阴性及假阳性和污染的存在.
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肝细胞核因子4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型建立及初步应用
目的 建立一种肝细胞核因子4α(HNF4α)增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型.方法 从临床获得的急性乙型肝炎患者血清中扩增并克隆HBV全长DNA;手术获得肝组织中提取总RNA,扩增并克隆HNF4α基因cDNA.BspQI/ScaI双酶切回收HBV全长DNA,HNF4α基因cDNA定向连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA3.1-4α表达载体.将HBV全长DNA 1 μg/孔,按比例共转染pcDNA3.1-4α(0,0.5 μg,1μg)于HepG2细胞,96 h后检测细胞上清中的HBsAg、HBeAg和HBV DNA;以0.5 μg/1 μg pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA共转染HepG2细胞,加入不同浓度LAM(0,100 μmol/L)和ETV(0,10 μmol/L),评价建立的体外复制模型.结果 1％ TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定HBV全长DNA和HNF4α cDNA PCR产物,条带长度为3.2 kb和1.5 kb;目的片段克隆后测序鉴定正确.胶回收HBV全长DNA克隆质粒酶切目的片段,构建的pcDNA3.1-4a表达载体酶切鉴定正确后,测序鉴定.不同浓度比例的pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA转染HepG2细胞后,0 μg/1 μg组合:HBeAg阴性,HBsAg阴性,上清HBV DNA载量为103;0.5 μg/1μg组合:HBeAg阴性,HBsAg A值从0.1升高到1.99,上清HBV DNA载量从1×103 IU/mL升高到4×104 IU/mL;1 μg/1 μg组合:HBeAg阴性,HBsAg A值从0.1升高到2.4,上清HBV DNA载量从1×103 IU/mL升高到1×105 IU/mL;LAM从0～100 μmol/L,细胞上清HBV DNA降低了97.6％;ETV从0～10 μmol/L,上清HBV DNA降低了99.0％.结论 HNF4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型,可以体外评价临床常用抗病毒药物,为后续HBV研究提供新思路.
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基于2a基因型丙型肝炎病毒自身启动子的单顺反子复制子的构建和功能测定
目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)单顺反子复制子,研究其在Huh7.5和Huh7.1细胞中的复制功能,为研究HCV复制规律和抗病毒药物的筛选建立模型. 方法 用Quick change点突变方法删除pJ6JFH 1B1aRL质粒上的Core-E1-E2-p7-NS2片段(约3090 bp),得到△pJ6JFH1B1aRL,然后测序,选择序列正确的克隆,用AgeⅠ和AvrⅡ酶切回收目的片段约2280bp,同时用AgeⅠ和AvrⅡ酶切pSGRJFH1和其突变体质粒,回收载体片段.将目的片段和载体片段连接,构建由HCV-IRES启动的单顺反子复制子pSGRm-JFH IblaRL以及其变异突变体pSGRm-JFH 1b1aRLGND,用其RNA转染Huh7.5和Huh7.1细胞,研究复制子在细胞中的复制情况.结果 经过Quick change和多步克隆方法成功构建HCV-IRES启动的单顺反子复制子,复制子RNA转染Huh7.5和Huh7.1细胞72h后复制达高峰,96h复制开始下降,而对照的突变体从24h至96h均没有复制.结论 成功构建了HCV-IRES单顺反子复制子,转染Huh7.5和Huh7.1细胞后在不同时间均有复制.
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组织工程骨修复长骨骨缺损的护理
骨组织工程是通过将骨髓干细胞接种在可生物降解的支架材料上,先在体外复制得到有生命的骨组织,再将其植入体内完成骨缺损的修复与功能的替代.临床上长骨骨缺损非常常见,如骨囊肿、骨纤维结构不良、骨不连、骨肿瘤等,传统治疗方法骨的来源非常有限,组织工程骨的应用为解决骨源这一难题提供了保障与便利.2002年10月～2004年12月,我科共收治19例骨缺损病例.经组织工程骨修复治疗,均完全修复,创面Ⅰ期愈合,功能完全恢复正常.
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HCV体外复制细胞模型的建立
目的建立HCV体外复制细胞模型.方法用含有生长HCV基因的p90/HCVFL-longp U质粒,转化Sure细胞,36℃摇菌18 h,提取质粒,以线性化DNA为模板,用T7RNA体外转录系统作体外转录,转录产物RNA作RT-PCR、普通琼脂糖凝胶电泳鉴定.采用lipofectin包裹HCVRNA转染生长良好的HepG2细胞.转染48 h后收集细胞,TRIzol提取RNA,分别用正链及负链引物作RT-PCR,确定转染细胞中有无HCV的复制中间体及病毒核酸.作免疫组化确定有无病毒NS3、NS5抗原.结果体外可获得高浓度全长HCV-RNA,但转染未获成功.结论全长HCV-RNA转染细胞模型的建立尚需进一步研究.
