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高浓度氧通过抑制黏着斑激酶表达损伤早产大鼠肺泡Ⅱ型细胞
目的 探讨高浓度氧暴露不同时间点早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)凋亡规律及其与黏着斑激酶(FAK)表达的关系.方法 原代培养早产鼠AECⅡ,暴露于高氧环境中6、12、24和48 h,并以空气组作为对照组,采用Annexin-Ⅴ和PI双标法经流式细胞仪检测AECⅡ凋亡情况,并采用Western印迹、RT-PCR技术分析AECⅡFAK多肽、磷酸化FAK(FAK-Tyr397)多肽和FAKmRNA表达变化.结果 与空气组比较,高氧暴露12 h,Annexin-Ⅴ+/PI(早期凋亡)亚群细胞所占比例高,达(23.83±4.43)%.随高氧暴露时间延长,Annexin-Ⅴ+/PI-亚群细胞所占比例逐步减低,而Annexin-Ⅴ+/PI+亚群细胞所占比例逐步增高(P<0.05或P<0.01).AEC Ⅱ FAK、FAK-Tyr397多肽及FAK mRNA表达水平随高氧暴露时间延长呈明显下降趋势(P<0.05或P<0.01).结论 高浓度氧抑制FAK表达可能是AECⅡ凋亡和坏死的重要原因之一.
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黏着斑激酶在肿瘤坏死因子α上调人角膜上皮细胞明胶酶活性中的作用
目的 探讨黏着斑激酶(FAK)在肿瘤坏死因子α(TNF-α)上调体外培养人角膜上皮细胞明胶酶活性中的作用.方法 实验研究.体外培养无眼部疾患人角膜上皮细胞,将传至3～4代的细胞暴露于含1 μg/L TNF-α(B组)、10 μg/L TNF-α(C组)、100 μg/L TNF-α(D组)的培养基中,对照组(A组)用含等量磷酸盐缓冲液(PBS)的培养基处理,明胶酶谱分析各组条件培养基中基质金属蛋白酶2和9( MMP-2、MMP-9)的活性,免疫印迹法分析FAK总蛋白表达及磷酸化FAK的表达；运用RNA干扰技术特异性抑制人角膜上皮细胞FAK的表达并重复以上过程.统计学方法使用单因素方差分析,各组间比较采用Tukey HSD检验.结果 明胶酶谱分析:与A相比,B、C、D组MMP-2、MMP-9活性均明显上调,差异有统计学意义(A、B、C、D组MMP-2活性表达分别为:124.06 ±4.06、146.72±5.51、241.18±5.65、389.95±4.44,F=2960.91,P=0.000；MMP-9活性表达分别为:122.78±5.86、165.70±7.90、479.49±6.22、495.88±5.03,F=4937.46,P=0.000),各组间比较差异均有统计学意义(MMP-2各组间比较均为P=0.000；MMP-9各组间比较P=0.000)；免疫印迹分析:C、D组中磷酸化FAK较A组增加,差异有统计学意义(C、D组磷酸化FAK分别为:0.52±0.03、0.61 ±0.06;F=431.03,P=0.000),100 μ.g/L TNF-α组较10 μg/L TNF-α组中磷酸化FAK表达增加(P=0.005)；运用RNA干扰技术特异性抑制人角膜上皮细胞FAK表达后,FAK总蛋白较特异性抑制之前明显下调,B、C、D组MMP-2的活性差异无统计学意义(转染后A、B、C、D组MMP-2分别为:55.13±0.66、55.67±0.43、55.49±0.20、55.91±0.37；F=2.73,P=0.079).10、100μg/L TNF-α干预组中MMP-9少量增加(转染后A、B、C、D组MMP-9分别为:80.48±0.39,81.26±0.62,84.43±0.47,85.56±0.61；F=105.80,P=0.000)但增加幅度较转染前明显减小,D组较C组MMP-9活性增强,差异有统计学意义(P=0.019).仅在100 μg/L TNF-α干预组中检测到FAK磷酸化(0.47±0.05),但表达量较抑制前明显减少(t=5.03,P=0.001).结论 FAK信号在TNF-α上调入角膜上皮细胞明胶酶活性过程中发挥一定作用,针对这一过程干预可能对防治角膜病变有意义.
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咖啡酸苯乙酯靶向调控人结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号通路的研究
目的 探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号转导通路中相关蛋白表达的作用,寻找其作用靶点,试图阐明CAPE抗肿瘤作用的分子机制.方法 用不同浓度CAPE处理HT-29细胞,利用Hoechst33258染色法和流式细胞术,检测细胞凋亡的发生.应用Western印迹法分析不同浓度CAPE对HT-29细胞中黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)蛋白表达的影响.结果 Hoechst33258染色发现CAPE作用后凋亡细胞数量增加.流式细胞仪细胞凋亡率分析显示,0,2.5,5.0,7.5和10 μg/ml处理HT-29 细胞24 h后,细胞凋亡率上升,呈剂量依赖性.Western印迹结果显示,在0～10 μg/ml范围内不同浓度CAPE作用于HT-29细胞24 h后,FAK、ERK蛋白表达随CAPE浓度的增加而下调.结论 CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,其作用机制可能与CAPE抑制FAK-ERK信号转导通路的激活有关.
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舒尼替尼对人高转移肝癌细胞株MHCC97-H局部黏着斑激酶表达的影响
目的：探讨舒尼替尼对人高转移肝癌细胞株MHCC97-H的体外杀伤作用，以及对局部黏着斑激酶（FAK）表达水平的影响。方法 MHCC97-H肝癌细胞培养传代，空白对照组不加舒尼替尼，实验组加2.5、5、10和20μmol/L的舒尼替尼，分别作用24、48和72 h。采用瑞氏吉姆萨法染色，观察用药前后MHCC97-H肝癌细胞的形态学变化；MTT法检测细胞的增殖抑制率；用Western blot检测用药前后FAK的蛋白表达。结果舒尼替尼对肝癌细胞株MHCC97-H有抑制作用，瑞氏吉姆萨法染色200倍光镜下可观察到染色质固缩、胞核碎裂及凋亡小体等典型的凋亡形态。药物作用48 h时抑制率明显，空白对照组，2.5、5、10和20μmol/L浓度下抑制率分别为（0.433±0.115）%、（32.863±1.471）%、（49.240±2.256）%、（63.797±2.707）%和（58.887±3.409）%，各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。Western blot结果显示经不同浓度舒尼替尼作用48 h后，FAK蛋白的表达水平出现不同程度的下降，各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论舒尼替尼对肝癌细胞株MHCC97-H有抑制及促凋亡作用，并能降低FAK蛋白的表达。
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CXCR4-FAK信号通路在低氧预处理骨髓间充质干细胞向大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织迁移和粘附中的作用
目的 探讨CXC趋化因子受体4-粘着斑激酶(CXCR4-FAK)信号通路在低氧预处理骨髓间充质于细胞(BMSC)向大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织迁移和粘附中的作用.方法 第一部分重组腺病毒介导绿色荧光蛋白基因转染成功的大鼠原代BMSC,以1×106个/ml密度接种于24孔培养板(1 ml/孔),采用随机数字表法,将其分为5组(n=18):对照组(C组)、常氧培养组(N组)、低氧预处理组(H组)、低氧预处理+ CXCR4拮抗剂AMD3100组(HA组)和低氧预处理+FAK抑制剂粘着斑相关非激酶组(HF组).N组BMSC在常氧环境中培养36 h;H组BMSC在低氧环境中培养24h后在常氧环境中继续培养12 h;HA组和HF组于低氧预处理前分别加入5 μg/ml AMD3100和10 μg/ml粘着斑相关非激酶.测定BMSC中基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)、CXCR4和磷酸化FAK(p-FAK)表达、BM-SC向SDF-1α迁移能力和BMSC与纤维粘连蛋白(FN)粘附能力.第二部分 雄性SD大鼠216只,体重300 ～ 350 g,其中210只采用阻断胸主动脉合并体循环低血压的方法制备脊髓缺血再灌注损伤模型.取脊髓缺血再灌注大鼠36只,分别于模型制备前、再灌注12h、1、3、5、7 d(T0-5)时处死6只大鼠,取腰段脊髓组织,检测SDF-1α含量.其余脊髓缺血再灌注大鼠180只,采用随机数字表法,将其分为5组(n=36),于再灌注即刻分别鞘内注射C组DMEM培养液300μl和N组、H组、HA组、HF组1×106个/ml BMSC悬液300μl.分别于T0-5时取6只大鼠,进行神经行为学评分,然后取腰段脊髓组织,测定BMSC聚集度.结果 与C组比较,N组BMSC的SDF-1α、CXCR4、p-FAK表达及其向SDF-1α迁移能力、与FN粘附能力、神经行为学评分和脊髓组织BMSC聚集度差异无统计学意义(P＞0.05)；与N组比较,H组BMSC的SDF-1α、CXCR4和p-FAK表达上调,向SDF-1α迁移能力、与FN粘附能力、神经行为学评分和脊髓组织BMSC聚集度升高(P＜0.05),HA组和HF组BMSC的p-FAK表达及其向SDF-1α迁移能力、与FN粘附能力、神经行为学评分和脊髓组织BMSC聚集度差异无统计学意义(P＞0.05)；与H组比较,HA组和HF组BMSC的p-FAK表达下调,向SDF-1x迁移能力、与FN粘附能力、神经行为学评分和脊髓组织BMSC聚集度降低(P＜0.05).与T0时比较,T2.3时脊髓组织SDF-1α含量升高(P＜0.05).结论 低氧预处理通过CXCR4-FAK信号通路促进BMSC向大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织迁移,并与之粘附,从而发挥脊髓保护作用.
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大麻素受体1、FAK mRNA在小鼠肝纤维化形成过程中肝组织中的表达及相互关系
目的 研究大麻素受体1(CB1)mRNA在肝纤维化形成过程中表达的变化,从基因转录水平探讨其与黏着斑激酶(FAK)的关系.方法 采用10%四氯化碳腹腔注射制备肝纤维化模型,分别于造模第2、4、6、8周留取小鼠的肝组织及血清.通过肝组织病理对肝纤维化程度进行评分,荧光定量PCR检测CB1 mRNA和FAK mRNA水平,ELISA方法检测血清中转化生长因子(TGF)β1的含量.结果 与正常对照组相比,各模型组小鼠肝组织中CBI mRNA和FAK mRNA含量显著升高(P<0.05),而且随造模时间的延长,CB1 mRNA和FAK mRNA含量亦逐渐增高,各组之间差异有统计学意义(P<0.05).CBI mRNA的含量不但与肝纤维化评分呈显著正相关(r=0.747),而且与肝组织中FAK mRNA含量也呈显著正相关(r=0.907),P值均<0.01.各模型组小鼠血清中TGFβ1的水平随造模时间延长而不断升高,各组间差异具有统计学意义(P<0.05).肝组织中CBI mRNA的含量与血清TGFβ1水平呈显著正相关(r=0.542,P<0.01).结论 CBI可能通过激活FAK,以磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路诱导肝星状细胞(HSC)增殖并分泌大量TGFR1,从而促进肝纤维化的形成.
关键词： 受体 大麻酚 CBI 黏着斑蛋白酪氨酸激酶类 肝硬化 -
Peg10基因在黏着斑激酶介导的肝癌细胞耐药中的作用
目的 初步探讨Peg10基因与黏着斑激酶(FAK)介导的肝癌细胞耐药(CAM-DR)的关系及分子机制.方法 采用MTT法检测5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(ADR)对L02细胞、ADR耐药的人肝癌细胞BEL-7404/ADR(7404/ADR)和Peg10基因沉默的siRNA-BEL-7404/ADR(siRNA-7404/ADR)细胞增殖的影响;建立7404/ADR和siRNA-7404/ADR裸鼠荷瘤模型,48只裸鼠随机分为6组,每组8只,A、C、D组注射7404/ADR细胞,B、E、F组注射siRNA-7404/ADR细胞;A、B组尾静脉注射生理盐水,C、E组给予5-Fu,D、F组给予尾静脉注射ADR,测量瘤块体积,RT-PCR检测Peg10基因的表达,Western Blot法检测PEG10、p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白的表达.两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析.结果 ADR和5-Fu对siRNA-7404/ADR 24 h的IC50值均较7404/ADR的降低,差异均具有统计学意义(t值分别为7.641,7.560,P值均＜0.01).B、C、D组肿瘤体积较A组小,差异均有统计学意义(P值均＜0.05),E、F组肿瘤体积较B组小,差异均具有统计学意义(P值均＜0.01);E组与C组比较,F组与D组的肿瘤体积差异亦均有统计学意义(P值均＜0.05).B、E、F组Peg10的mRNA极少表达,C、D组Peg10的mRNA表达较A组有所降低.B组PEG10蛋白极少表达,与A组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01),其p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白表达与A组比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).C、D组PEG10、p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白的表达较A组均降低,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).E、F组p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白表达与B组比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.01),而C组与E组、D组与F组相比,PEG10、p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白的表达差异亦均有统计学意义(P值均＜0.01).结论 Peg10基因失活后可增加ADR耐药的BEL-7404细胞株对5-Fu和ADR的敏感性,其作用机制可能与其下调p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白的表达有关.
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朝鲜白头翁、人参和甘草的复合水提物的抗血管生成作用
目的:本研究旨在证实朝鲜白头翁、人参和甘草的复合水提物(water extract of Pulsatilla koreana (Yabe ex Nakai) Nakai ex T.Mori.,Panax ginseng C.A.Meyer and Glycyrrhiza uralensis Fisch,WEPPG)的抗血管生成作用.方法:使用纤维母细胞生长因子致血管生成的人类脐静脉内皮细胞模型衡量细胞的增殖、黏附及迁移,同时进行细管形成实验及纤维母细胞生长因子致鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验检测WEPPG的抗血管生成作用.结果:WEPPG能够显著抑制纤维母细胞生长因子所致血管生成的人类脐静脉内皮细胞的增殖、黏附及迁移.信号蛋白分析显示多种蛋白表达变化,如细胞周期素A、p63、KIP2的上调及nibrin蛋白和黏着斑激酶的下调.与对照组相比,WEPPG显著减少了鸡胚绒毛尿囊膜血管生成.结论:本研究的结果证实了WEPPG的抗血管生成作用,这可能是这种药物具有抗癌功效的原因之一.
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Paxillin、FAK和PTEN在胃腺癌组织中的表达及其临床意义
背景:研究表明Paxillin、黏着斑激酶(FAK)和PTEN在许多肿瘤的发生、发展、侵袭、转移中发挥重要作用,但联合检测三者在胃癌中表达的报道罕见.目的:研究正常胃黏膜和胃腺癌组织中Paxillin、FAK和PTEN的表达及其临床意义.方法:以免疫组化SP法分别检测40例正常胃黏膜组织和88例胃腺癌组织中Paxillin、FAK和PTEN表达,并分析其与胃腺癌临床病理特征的关系以及Paxillin与PTEN表达之间的相关性.结果:与正常胃黏膜组织相比,胃腺癌组织Paxillin(65.9%对32.5%,P<0.05)、FAK(56.8%对17.5%,P<0.05)阳性表达率显著增高,PTEN阳性表达率显著降低(47.7%对100%,P<0.05).Paxillin、FAK和PTEN表达与胃腺癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05),与性别和年龄无关.胃腺癌组织中Paxillin表达与PTEN表达呈显著负相关(r=-0.369,P<0.05).结论:Paxillin、FAK高表达和PTEN低表达可能与胃腺癌的浸润、淋巴结转移等恶性生物学行为相关,联合检测三者可能有助于判断胃腺癌恶性程度和患者预后.
关键词： 桩蛋白 黏着斑蛋白酪氨酸激酶类 PTEN磷酸水解酶 胃肿瘤 免疫组织化学 -
肾综合征出血热患者循环内皮细胞中黏着斑激酶的表达
目的 检测肾综合征出血热(HFRS)患者循环内皮细胞(CEC)中磷酸化黏着斑激酶910(FAKps910)的表达.方法 50例HFRS患者按病情分为轻型17例,中型20例,危重型13例,另纳入健康对照组20例.Percoll密度梯度离心法分离内皮细胞,流式细胞技术检测APC-CD31特异性标记的CEC中FAKps910的表达.数据行单因素方差分析.结果 发热早期CEC中FAKps910阳性表达率为j9.87%±9.58%,健康对照组为21.14%±2.53%,发热期末或低血压休克期为11.64%±2.17%(F=262.31,P＜0.01),以后恢复至正常.发热期末或低血压休克期CEC中FAKps910的阳性率在轻型患者为17.45%±2.64%,中型为13.84%±2.54%,危重型为7.47%±2.57%,各型及与健康对照组之间差异均有统计学意义(F=52.642,P＜0.01).结论 HFRS患者CEC中黏着斑激酶(FAK)与病情轻重有关,FAKps910可能参与汉坦病毒引起的83整合素介导的血管内皮细胞损伤.
关键词： 肾综合征出血热 内皮 血管 黏着斑蛋白酪氨酸激酶类 -
富含半胱氨酸蛋白61对人肾小管上皮细胞增殖与细胞周期的影响
目的 观察富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)蛋白对人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖与细胞周期的影响.方法 细胞被分为空白对照、阴性对照和Cyr61转染组.克隆Cyr61cDNA,构建pEGFP-N2-Cyr61重组质粒,利用脂质体分别将重组质粒与pEGFP-N2空质粒瞬时转染HK-2.四唑盐比色实验(MTT)检测细胞增殖；流式细胞分析术检测转染效率和细胞凋亡率；Western印迹法检测Cyr61蛋白、磷酸化黏着斑激酶(p-FAK)、细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)的表达.结果 pEGFP-N2-Cyr61重组质粒可高效转染HK-2缅胞.与空白对照、阴性对照组相比,Cyr61转染组细胞和培养液中的Cyr61蛋白表达量显著提高,细胞增殖活力明显增强,细胞中G1时相的比例显著减少,S时相显著增加,细胞凋亡率下降(均P＜0.01).Cyr61转染组细胞中p-FAK、CDK2表达量亦显著提高(P＜0.01).结论 高表达的Cyr61蛋白可通过FAK途径促进CDK2表达,从而促进HK-2细胞进入S期,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡.
