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急性白血病/骨髓增生异常综合征患者DNA甲基转移酶亚型的表达
目的探讨DNA甲基转移酶(DNMTs)亚型与急性白血病(AL)发病及骨髓增生异常综合征(MDS)向AL转化的关系.方法半定量逆转录(RT)-PCR技术测定75例AL/MDS患者的DNMT1、3A及3B的mRNA表达水平.结果低危MDS组(21例) DNMT各亚型的表达升高与正常对照组平均值无统计学差异,但以正常对照组平均值的80%单侧上界为界,则分别为47.6%、47.6%和42.9%,高于正常对照 (P＜0.01).高危MDS 组(13例)分别为53.8%、76.9%和92.3%高于正常对照(P＜0.01),其中DNMT 3B表达显著高于低危MDS组(P＜0.01),而DNMT1和3A表达与低危组差异无显著性.AL组(41例)DNMT1、3A及3B分别为92.7%、97.6%和100%高于正常对照(P＜0.01),且三种DNMT亚型表达水平均显著高于MDS组 (P＜0.01). 急性淋巴细胞白血病组DNMT1表达显著高于急性髓细胞白血病组(P＜0.01),而二组的DNMT3A,3B表达无统计学差异.结论 DNMTs表达水平的增高与AL的发病及MDS向AL转化过程密切相关,并以DNMT 3B的关系为密切.
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沉默DNA甲基转移酶1基因对子宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响
目的 利用RNA干扰技术沉默宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基转移酶(DNMT)1基因的表达,探讨沉默DNMT1基因后对HeLa细胞增殖及凋亡的影响.方法 针对DNMT1基因构建短发夹状RNA(shRNA)重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒,并行酶切鉴定和测序分析.采用RT-PCR技术筛选出其中RNA干扰效果佳的重组载体,通过脂质体介导转染宫颈癌HeLa细胞(转染组),以空载体组(转染空载体pSilencer3.1-H1质粒)和未转染组(未作任何处理)为对照.采用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检测转染前后HeLa细胞中DNMT1 mRNA和蛋白表达的变化,活细胞计数(CCK-8)法和双染法流式细胞术分别检测转染前后HeLa细胞增殖和凋亡的变化.结果 (1)酶切鉴定和测序分析证实,靶向DNMTI的3个shRNA重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒构建成功.RT-PCR技术筛选显示,重组载体pshRNA-DNMT1-B质粒的干扰效果佳.(2)RT-PCR技术检测显示,转染组转染24、48及72 h时HeLa细胞中DNMT1 mRNA的相对表达水平分别为0.406±0.057、0.191±0.036、0.104±0.015,明显低于空载体组和未转染组(分别为0.520±0.020、0.537±0.041,P＜0.05).蛋白印迹法检测显示,转染组转染24、48及72 h时细胞中DNMT1蛋白的相对表达水平分别为0.197±0.024、0.075±0.015、0.040±0.013,明显低于卒载体组和未转染组(分别为0.273±0.010、0.283±0.016,P＜0.05).(3)CCK-8法检测显示,转染组转染24、48、72、96、120 h时HeLa细胞存活率分别为70.8%、64.8%、51.6%、45.3%、38.0%,分别与空载体组和未转染组各时间点比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).双染法流式细胞术检测显示,转染组转染24、48及72 h时的细胞凋亡率分别为(17.7±1.3)%、(35.3±1.3)%、(47.6±1.6)%,明显高于空载体组及未转染组[分别为(4.9±0.5)%、(5.1±0.7)%,P＜0.05].结论 RNA干扰技术能成功沉默宫颈癌HeLa细胞中DNMT1基因的表达,通过下调DNMT1基因的表达可抑制宫颈癌细胞增殖、促进细胞凋亡.
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组织芯片技术检测DNA甲基转移酶1、人白细胞DR抗原α在肝细胞癌组织中的表达及临床意义
目的:探讨肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)组织中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)、人白细胞DR抗原α(HLA-DRα)的表达情况及其与临床病理特征、预后的关系.方法:选择1991年1月至2002年6月实施根治性肝切除、经病理证实的具备完整临床和随访资料的234例HCC患者,患者的随访时间为1.43～158.8个月[(30.04±26.61)个月],将患者的HCC石蜡组织制备成组织芯片,免疫组化检查采用Envision二步法,统计软件分析DNMT1和HLA-DRα的表达与临床病理特征、预后的关系.结果:HCC组织中DNMT1的阳性表达率为27.4%(64/234),其阳性表达与门静脉癌栓、甲胎球蛋白(AFP)水平、TNM分期具有明显的相关性(P<0.05),与淋巴结侵犯无明显相关(P0.05).HCC组织中HLA-DRα的阳性表达率为39.3%(92/234),HLA-DRα的阳性表达与淋巴结侵犯、TNM分期具有明显的负相关性(P<0.05),与门静脉癌栓、AFP水平等无明显相关(P0.05).DNMT1表达阳性的患者术后的中位存活时间为6.87个月,1年、3年、5年存活率分别是(38.89±6.63)%、(19.92±5.48)%、(17.58±5.31)%;DNMT1表达阴性患者的中位存活时间为40.33个月,1年、3年、5年存活率分别为(80.0±3.32)%、(51.63±4.30)%、(35.61±4.95)%(P<0.001).HLA-DRα表达阳性患者的术后中位存活时间为40.33个月,1年、3年、5年存活率分别为(81.01±4.41)%、(50.78±5.84)%、(38.04±6.09)%;HLA-DRα表达阴性患者的中位存活时间为12.43个月,1年、3年、5年存活率分别为(51.72±6.56)%、(26.44±5.91)%、(13.71±6.83)%(P<0.01).结论:DNMT1和HLA-DRα可能是影响HCC预后的重要分子,有望成为准确预测HCC预后的分子预后标记物.
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子宫内膜异位症患者血清与腹腔液中DNA甲基转移酶的测定
目的:检测子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)患者DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase,DNMT1)及DNMT3B在血清与腹腔液中的表达,探讨EMs增殖期和分泌期存在的甲基化改变.方法:选取2013年7-12月在北京大学深圳医院妇科及计划生育科行宫腹腔镜手术,并证实为EMs的患者61例作为研究组,其中Ⅰ～Ⅱ期39例(A组),Ⅲ～Ⅳ期22例(B组),选取同期行宫腹腔镜手术证实为非EMs的27例患者作为对照组(C组).采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定3组增殖期和分泌期患者DNMT1及DNMT3B在血清及腹腔液中的表达.结果:①B组增殖期患者DNMT1在血清中的表达高于A组和C组增殖期患者,A、B组增殖期患者DNMT3B在血清中的表达高于C组增殖期患者,差异均有统计学意义(P＜0.01).②A组增殖期患者DNMT3B在腹腔液中的表达高于B组和C组增殖期患者,差异有统计学意义(P＜0.01).③3组分泌期患者DNMTs在血清及腹腔液中的表达差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:增殖期时EMs体内甲基化改变明显,且EMs不同分期的甲基化状态的改变也有差异,提示增殖期DNA甲基化改变在EMs的发生发展过程中起重要作用.
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DNA甲基转移酶在胚胎停育绒毛组织中的表达差异及临床意义
目的：探讨胚胎停育绒毛组织中DNA甲基转移酶（DNMTs）4种亚型DNMT1、DNMT3A、DNMT3B与DNMT3L的mRNA及蛋白表达差异，并探讨其临床意义。方法：随机选取2013年1月-2014年6月在青岛市立医院妇产科门诊就诊的经B型超声（B超）证实为胚胎停育而行清宫术的40例患者为观察组，并选取同期正常早孕要求人工流产的40例患者为对照组。①采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测2组患者绒毛组织中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B与DNMT3L mRNA的表达量；②用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（SP法）及蛋白质印迹法（Western blot）检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B与DNMT3L蛋白在观察组和对照组患者绒毛组织中的表达部位及定量差异。结果：①qRT-PCR结果显示，2组患者绒毛中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA的表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；②免疫组化结果显示，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B与DNMT3L在2组绒毛滋养细胞的细胞核或细胞质呈不同程度的阳性染色，同时，半定量分析结果显示观察组的DNMT3A蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；③Western blot分析结果显示，观察组患者绒毛中DNMT3A蛋白的相对表达量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；④胚胎停育绒毛组织中DNMT3A蛋白的表达量与DNMT1、DNMT3B和DNMT3L蛋白表达量之间无明显关联（均P＞0.05）。结论：胚胎停育绒毛组织中，DNMT3A蛋白水平的低表达可能参与了胚胎停育的发病机制。
关键词： 妊娠初期 胎儿疾病 DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶 绒毛膜绒毛 -
DNMT1基因多态性和被动吸烟与宫颈癌的相关性
目的：研究甘肃地区汉族女性DNA甲基转移酶1（DNMT1）基因多态性和被动吸烟与宫颈癌的相关性。方法：采用病例对照研究方法，选取甘肃地区100例宫颈癌患者和100例健康对照者，应用聚合酶链反应和基因测序法检测DNMT1基因多态性，比较不同基因型、被动吸烟与宫颈癌之间的关系。结果：被动吸烟者发生宫颈癌的相对危险性是无被动吸烟者的2.705倍（P＜0.05）；宫颈癌组rs16999593位点C等位基因频率高于对照组（P＜0.05）。结论：DNMT1基因的单核苷酸多态性和被动吸烟增加了宫颈癌的发病风险。
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七氟醚麻醉对新生大鼠杏仁核DNA甲基转移酶mRNA表达的影响
目的 探讨七氟醚麻醉对新生大鼠杏仁核DNA甲基转移酶(DNMT)mRNA表达的影响.方法 新生(出生8 d)SD大鼠42只,采用随机数字表法,将其随机分为2组(n=21),对照组:不给予任何处理;实验组:吸入5%七氟醚1 min后,吸入浓度调整为3%维持4 h.实验组分别于停止吸入即刻及停止吸入后24 h时,处死大鼠,取杏仁核,测定DNMT1 mRNA、DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA的表达;停止吸入即刻取动脉血样,进行血气分析.对照组于相应时间点进行处理.结果 与对照组比较,实验组DNMT1 mRNA、DNMT3a mRNA表达均下调(P＜0.05),DNMT3b mRNA表达和血气分析指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 七氟醚麻醉可下调新生大鼠杏仁核DNMT1 raRNA和DNMT3a mRNA的表达,该作用可能会导致发育期中枢神经功能损伤.
关键词： DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶 婴儿 新生 杏仁核 七氟醚 -
散发性乳腺癌中DNA甲基转移酶1与乳腺癌易感基因1基因甲基化和蛋白表达的相关性
目的：本研究通过检测DNA甲基转移酶（DNM T ）1在散发性乳腺癌中的表达，分析DNM T1与乳腺癌易感基因（BRCA）1蛋白表达及基因启动子甲基化状态的相关性，以探讨DNMT1在散发性乳腺癌中的临床意义。方法应用免疫组织化学法检测182例散发性乳腺癌与30例乳腺纤维腺瘤组织中DNM T1蛋白的表达水平，应用甲基特异化聚合酶链反应（PCR）检测97例散发性乳腺癌组织中BRCA1基因启动子区甲基化状态，采用χ2检验、Fisher确切概率法、Spearman等级相关进行统计学分析。结果与乳腺纤维腺瘤相比，乳腺癌组织中DNM T1蛋白表达水平均显著增高（ P ＝0．013）；在发生淋巴结转移的组织中DNM T1蛋白表达量增多（ P ＝0．014）；用甲基特异化PCR法检测97例乳腺癌标本中BRCA1蛋白基因启动子区甲基化率为19．6％；DNM T1蛋白的表达与BRCA1基因启动子区甲基化呈正相关（ r ＝ 0．349，P ＜0．01）；BRCA1和DNM T1阳性表达有降低患者总体生存期（OS）（ P ＝0．059，P ＝0．041）和无病生存期（DFS）（ P ＝0．054，P ＝0．026）的趋势。结论乳腺癌中DNM T1蛋白高表达与肿瘤侵袭转移相关，并且可能存在DNM T1催化BRCA1基因甲基化，从而下调BRCA1蛋白表达，进而导致乳腺癌患者预后不良的机制，提示抑制DNM T1可能利于乳腺癌的治疗。
关键词： 乳腺肿瘤 基因 BRCA1 免疫组织化学 DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶 -
亚砷酸钠对HaCaT细胞MGMT基因启动子区甲基化CpG结合蛋白-2、DNA甲基转移酶1、组蛋白去乙酰化酶1结合的影响
目的 观察亚砷酸钠(NaAsO2)对人肤角质形成细胞株(HaCaT细胞)MGMT基因启动子区甲基化CpG结合蛋白-2(MeCP2)、DNA甲基转移酶1(DNMT1)及组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)结合情况的影响,为深化阐释砷毒作用机制提供依据.方法 分别以0.00(空白对照)、3.13、6.25、12.50、25.00 μmol/L NaAsO2重复间隔处理HaCaT细胞72 h(NaAsO2处理24h,隔天再次相同处理,重复3次),以人表皮鳞癌细胞株(A431)作为阳性对照,定量染色质免疫共沉淀技术(Q-ChIP)检测MGMT基因转录调控区ChIP1、ChIP2区域及MGMT基因编码区ChIP3区域MeCP2、DNMT1、HDAC1结合情况.结果 各组HaCaT细胞MGMT基因转录调控区ChIP1、ChIP2区域MeCP2、DNMT1、HDAC1蛋白结合水平比较,差异有统计学意义(F值分别为7.387、84.634、78.442和19.263、69.649、26.546,P均＜0.05)；其中各NaAsO2处理组ChIP1、ChIP2区域MeCP2、DNMT1、HDAC1蛋白结合水平[3.13 μmol/L NaAsO2处理组:(136.00±16.97)％、(145.00±2.83)％、(88.50±19.09)％和(106.50±37.48)％、(112.34±8.73)％、(59.71±8.49)％；6.25 μmol/L NaAsO2处理组:(130.00±42.43)％、(154.50±4.95)％、(101.00±1.27)％和(88.50±3.54)％、(134.32±2.82)％、(102.75±19.91)％;12.50 μmol/LNaAsO2处理组:(141.50±23.33)％、(161.50±7.78)％、(125.00±11.31)％和(119.50±24.75)％、(171.59±3.54)％、(167.61±10.61)％;25.00 μmol/NaAsO处理组:(134.50±43.13)％、(472.50±50.20)％、(383.50±30.41)％和(180.09±12.73)％、(348.50±27.58)％、(158.45±12.02)％]均高于空白对照组[(51.50±9.19)％、(82.00±12.73)％、(25.03±2.91)％和(37.02±4.24)％、(91.56±26.16)％、(19.09±2.90)％,P均＜0.05].各组HaCaT细胞MGMT基因编码区ChIP3区域MeCP2蛋白结合水平比较,差异无统计学意义(F=1.670,P＞0.05),而DNMT1、HDAC1蛋白结合水平比较,差异有统计学意义(F值分别为4.404、9.863,P均＜0.05),其中25.00 μmol/L NaAsO2处理组DNMT1、HDAC1蛋白结合水平[(615.85±29.63)％、(306.09±59.40)％]与空白对照组[(99.70±12.02)％、(92.45±48.79)％]比较,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 MeCP2可结合于砷所致高甲基化MGMT基因转录调控区,通过招募DNMT1及HDAC1使组蛋白去乙酰化,同时DNMT1可结合于MGMT基因编码区,以非甲基化DNA结合蛋白(MBD)依赖的方式招募HDAC1,通过染色质重塑方式导致MGMT基因沉默,可能是砷毒性表现的早期分子事件.
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双氢青蒿素对前列腺癌PC-3细胞中UCHL1基因表达的调控机制研究
目的:研究双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人前列腺癌PC-3细胞株中抑癌基因泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1,UCHL1)表达的影响,并探讨其可能的调节机制.方法:PC-3细胞株经不同浓度(25、50和100 μmol/L)的DHA处理48 h,并设空白对照组.采用FCM法检测各组细胞凋亡率和细胞周期的变化.采用免疫荧光染色法检测UCHL1和DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在细胞内的蛋白定位及表达量.蛋白质印迹法检测UCHL1、DNMT1、磷酸化Akt (phospho-Akt,p-Akt)和Akt蛋白的表达;并且以1μmol/L磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)家族抑制剂Wortmanin作为阳性对照,比较分析DHA处理组p-Akt蛋白的表达量.结果:DHA能明显诱导PC-3细胞凋亡,并使细胞停滞在G2/M期,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).DHA处理组中DNMT1蛋白由细胞核转移到细胞质,与空白对照组比较,DNMT1蛋白在细胞核与细胞质中总的表达水平明显下调(P＜0.05);而UCHL1蛋白表达在细胞质内明显上调(P＜0.05).与空白对照组比较,DHA处理组与阳性对照组的UCHL1蛋白表达均上调(P＜0.05),DNMT1表达水平均下调(P＜0.05),p-Akt蛋白表达水平下调(P＜0.05),而Akt蛋白表达量无明显变化(P＞0.05);其中,高浓度DHA处理组的p-Akt蛋白表达下调更为显著,更接近于阳性对照组.结论:DHA能够抑制DNMT1的表达,恢复抑癌基因UCHL1的表达,从而诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡,阻滞细胞周期进程;推测其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路的活性有关.
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DNA甲基转移酶在肿瘤形成中的研究进展
DNA甲基化是基因表达调控中重要的调节方式之一,可通过影响癌基因和抑癌基因的表达以及基因组的稳定性而参与肿瘤形成.DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNMT)催化发生并维持的,并认为DNMT活性增高是肿瘤细胞具有特征的早期分子改变,因而受到越来越多的学者关注.
关键词： DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶 DNA甲基化 基因 肿瘤形成过程 -
新型DNA甲基转移酶抑制剂
DNA甲基化对肿瘤相关基因的表达起重要的调控作用,肿瘤细胞内甲基化模式的混乱是其发生的重要原因.研究表明DNA甲基转移酶抑制剂可以显著抑制肿瘤生长,有很好的治疗效果.现常见的甲基转移酶抑制剂为氮胞苷类,但因其缺乏特异性,毒副作用大,临床应用有限.新型甲基化酶抑制剂为小分子化合物,作用机制独特,性能良好,有很好药用开发前景.
关键词： DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶 肿瘤 -
ShRNA沉默基因DNA甲基转移酶3b的表达对膀胱癌T24细胞增殖的影响
目的 体外研究重组质粒pshRNA-DNMT3b对膀胱癌T24细胞中DNMT3bmRNA和蛋白的沉默效应以及细胞增殖抑制的影响,初步探讨DNMT3b在膀胱肿瘤发生过程中的作用.方法 实验分为空白对照组、HK组及pshRNA.DNMT3b组(24、48、72 h);常规培养T24细胞,用脂质体lipofectamine2000将重组质粒pshRNA-DNMT3b转染进入T24细胞,后进行RT-PCR、Western Blot、MTT检测,观察pshRNA-DNMT3b对T24细胞中DNMT3bmRNA、蛋白质水平变化以及细胞增殖的影响.结果 重组质粒pshRNA-DNMT3b成功的转染进入T24细胞;RT-PCR电泳结果用Gel-pro analyzer图像分析系统进行灰度分析,空白对照组、HK组、pshRNA-DNMT3b组(24、48、72 h)条带的IOD相对比值(DNMT3/13.actin)分别是(99.56±1.24)%、(99.12±1.35)%、(75.77±1.42)%、(44.69±1.05)%和(20.52±0.89)%;Westem blot图像分析结果各组的相对比值分别是(99.43±1.28)%、(98.90±1.31)%、(67.83±1.02)%、(43.43±1.05)%和(21.92±0.89)%;在MTT检测中空白对照组和HK组之间差异无统计学意义(P＞0.05),pshRNA-DNMT3b组仅在72 h后和前2组之间差异有统计学意义(P＜0.01),但抑制率仅增加0.45%左右.结论 重组质粒pshRNA-DNMT3b能有效的降低膀胱癌T24细胞中基因DNMT3b mRNA的转录及蛋白的表达,但在抑制细胞增殖上作用甚微.
关键词： DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶 RNA干扰 膀胱肿瘤
