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利用目标基因测序技术发现马方综合征FBN1新突变
目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对马方综合征(Marfan syndrome,MFS)患者的原纤维蛋白-1(fibrillin-1,FBN1)基因进行突变筛查,探讨MFS与FBN1基因突变的关系.方法:提取5例MFS患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术(北京迈基诺公司),设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用illumina hiseq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证.结果:设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段.5例患者目标区域平均测序深度为173.85 ～ 280.73,97.10％ ～ 98.00％目标区域＞4×覆盖度.经过数据分析及Sanger测序验证,发现1个新的无义突变c.5968 C＞T(p.Gln1990X).结论:本研究所建立的GenCap目标基因捕获技术结合illumina hiseq2000第二代测序技术成功的发现了FBN1的新突变.该方法快速而有效,可以使我们对MFS分子病因学有更好的认识.
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Dysferlinopathy患者临床表现与基因突变分析
目的 探讨dysferlinopathy患者基因突变与临床表现间的关系.方法 应用基因芯片捕获第二代测序技术对25例临床诊断为肌营养不良患者进行基因检测,用Sanger法进行家系验证.通过肌肉活检酶组织化学及免疫组织化学染色方法对部分患者行病理学检查.结果 10例患者存在19个不同位点的DYSF基因突变,其中10个为新位点,错义突变占53％.除1例患者为携带者外,9例诊断为dysferlinopathy,包括4例肢带型肌营养不良2B型、4例Miyoshi远端型肌营养不良、1例小腿前部无力的远端前群肌病,其中8例为复合杂合突变.结论 通过本研究,丰富了中国人群中DYSF突变的基因型,进一步加深了对dysferlinopathy临床和遗传高度异质性的认识.
关键词： Dysferlinopathy DYSF基因 第二代测序 复合杂合突变 -
动物线粒体基因组测序方法的研究进展
线粒体是具有独特DNA分子和完整遗传信息传递与表达系统的一类细胞器，参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动。线粒体DNA突变与线粒体疾病的发生密切相关，广泛应用于分子生物学、遗传学、法医学鉴定等各个方面。因此，线粒体基因组测序对于其结构功能的研究有重要价值。本文综述了线粒体基因组测序方法的研究进展，重点是第一代基因测序技术、聚合酶链反应（PCR）技术、第二代基因测序技术，以及滚环扩增技术和线粒体间接测序，并对每种方法的优缺点进行了总结，归纳了线粒体假基因对线粒体基因组分析过程中的干扰和处理策略。
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目标区序列捕获和第二代测序技术在Duchenne型肌营养不良基因诊断中的应用
目的 应用目标区序列捕获和第2代测序技术对Duchenne型肌营养不良患者进行基因检测,验证该方法的敏感度和特异度. 方法 应用目标区序列捕获和第2代高通量测序技术对19例临床诊断为Duchenne型肌营养不良患者进行基因检测,用Sanger法对8个微小突变患者样本进行测序验证. 结果 19例患者均发现遗传病因,大片段缺失11例,微小突变8例,经Sanger法测序验证. 其中3个微小突变为首次发现的新突变. 结论 目标区序列捕获和第2代测序技术可以1次检测DMD基因几乎全部的突变类型,极大地提高了检测效率,该方法敏感度高、特异性强,具有良好的临床应用前景.
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代谢综合征的发育程序化:利用第二代测序技术分析母胎高果糖摄取对子代大鼠转录组的影响
临床证据显示高果糖摄取与代谢综合征现象产生有高度相关性,然而关于母体在怀孕与哺乳期高果糖摄取对子代代谢综合征的发育程序化影响的研究却相对缺乏.本研究利用第二代测序(next-generation sequencing)技术分析母鼠高果糖摄取对新生第一天、离乳后一天(出生后三周)、以及成年期(出生后三个月)子代大鼠脑部、心脏、肾脏与膀胱四个器官转录组的影响.结果显示:(1)母鼠在怀孕与哺乳期高果糖摄取,会程序化胎鼠使其于成年期产生代谢综合征;(2)同时,在仔鼠脑部、心脏、肾脏与膀胱四个器官引起不同程度的转录组变化;(3)在新生第一天子代大鼠,有两个基因,分别是Errfil与Ctgf,同时在四个器官中表现受到影响,此现象在子代离乳与成年期则消失;(4)参与果糖代谢、糖酵解及糖异生、脂肪代谢、以及胰岛素信号传导通路的基因转录也受到不同程度影响,此现象在新生第一天尤为显著.该结果提示,可利用第二代测序技术寻找不同年龄层子代器官特异性受母体高果糖摄取影响的基因转录变化,进而研发代谢综合征发育程序化在不同器官引起病变的可能机制与治疗策略.
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第二代测序技术检测1例假肥大型肌营养不良家系Dystrophin基因突变
目的 探讨第二代测序(NGS)技术检测假肥大型肌营养不良患者的可行性.方法 用NGS技术检测1例假肥大型肌营养不良(DMD)患者,并用Sanger测序技术对患者基因型进行验证,同时检测家系其他成员基因型.结果 NGS技术结果表明,该患者DMD基因编码区第55号外显子存在1个移码突变c.8087delT(p.Leu2696ArgfsX30),为致病性突变;同时该患者还存在3个错义突变p.Arg2937Gln、p.Arg1745His和p.Asp882Gly,均为已知多态性变异;Sanger测序技术进一步证实了该点突变的存在,同时发现患者母亲为该突变的携带者,患者父亲和妹妹未见该突变.结论 NGS技术可用于DMD基因突变检测,为DMD临床遗传咨询和治疗提供了依据.
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细菌分子分型方案的发展及其比较
细菌感染的爆发流行是当今社会的常见问题,对菌株的正确分型是进行细菌流行病学及抗菌药物研究的关键.现代分子生物学技术的发展为细菌分型提供了可靠的保证,在判定感染的爆发、确定感染的病原菌、寻找感染源以及识别一些特殊致病菌等方面发挥着重要作用.目前,正致力于研究速度更快、成本更低、通量更高、更适用于应对突发事件和临床检验的测序分型方案.
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第二代测序技术在一中国先天性白内障家系致病基因检测中的应用
背景 某些遗传性疾病具有高度遗传异质性,因此传统的Sanger测序技术已经不能满足医学研究及临床工作的需求.第二代测序(NGS)技术由于具有费用低及检测速度快的优点而得到广泛应用,但在先天性眼病突变基因的检测中的应用效果有待验证.目的 探讨NGS技术对先天性白内障患者进行致病基因诊断和产前诊断的可行性.方法 于2013年1月收集来自河南省洛阳市的一汉族先天性白内障家系,抽取家系中3例患者(Ⅱ2、Ⅲ3、Ⅲ4)和3名表型正常者(Ⅱ3、Ⅲ1、Ⅲ2)的外周血各2 ml,EDTA抗凝,在河南省医学遗传研究所应用NGS技术对先证者进行基因突变位点检测,并采用Sanger测序技术对NGS结果进行验证,然后用Sanger测序技术对该家系其他成员的外周血样本进行突变位点的序列分析,根据确定的致病突变位点对先证者的胎儿进行产前诊断.本研究遵循赫尔辛基宣言,检测方案经河南省人民医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书.结果 该家系4代14位成员中共5例患者,其中男2例,女3例,分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代中,其他家系成员表型正常,符合常染色体显性遗传方式.NGS检测发现先证者Ⅲ3CRYBB1基因第6外显子上存在c.682T＞C(p.S228P)杂合突变,Sanger法验证了该点突变.Sanger法检测发现家系中患者均存在CRYBB1基因c.682 T＞C突变,而家系中表型正常者CRYBB1基因的c.682位点基因型为T/T野生型.产前诊断结果显示胎儿(Ⅳ1)CRYBB1基因c.682位点基因型为T/T野生型.结论 NGS可用于先天性白内障基因突变的快速检测,该家系致病性基因为CRYBB1基因c.682T＞C突变,应用NGS技术结合一代测序技术成功对先证者进行了产前诊断.
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利用目标基因捕获结合第二代测序技术发现腹主动脉瘤致病基因突变
目的 建立目标基因捕获结合第二代测序技术对腹主动脉瘤患者原纤维蛋白1(FBN1)基因进行突变筛查,探讨腹主动脉瘤与FBN1基因突变的关系.方法 提取4例腹主动脉瘤患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina HiSeq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证.结果 设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段.4例患者目标区域平均测序深度为448.15～536.61,99.5％ ～ 99.7％目标区域覆盖度.经过数据分析及Sanger测序验证发现1个新的错义突变c.2753 C＞G(p.Pro918 Arg),dbSNP137数据库、千人基因组及内部800名正常汉族人数据库均无此突变.经SIFT预测为有害突变.结论 本研究所建立的GenCap目标基因捕获技术结合Illumina HiSeq2000第二代测序技术成功地发现了FBN1的新突变.该方法快速而有效,对腹主动脉瘤分子病因学有更好的认识.
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第二代测序技术与无创产前诊断
孕妇外周血中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的发现开辟了无创产前诊断的新篇章,借助各种分子诊断技术针对cffDNA进行胎儿染色体疾病、遗传性疾病以妊娠相关疾病的研究迅速成为热点.以高通量、自动化为显著特征的第二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术诞生,极大加速了cffDNA的实验室研究进展.目前基于NGS平台,建立的胎儿21/18/13三体综合征的产前基因诊断技术已应用于临床,其他如性染色体非整倍体、双胎妊娠染色体非整倍体、胎儿染色体结构异常疾病以及孟德尔单基因遗传病的研究也因NGS的出现获得了显著的进步.本文就NGS的基本原理、cffDNA的生理特性及NGS在无创产前诊断研究中的进展进行综述.
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循环肿瘤DNA在头颈部肿瘤中的研究进展
癌症已成为中国人口死亡的首要原因.2015年中国流行病学调查研究显示,头颈部肿瘤占所有新发肿瘤的4.63％,占所有肿瘤死亡人数的2.24％.头颈部肿瘤的发病率及死亡率正在呈现上升的趋势,同时有年轻化的倾向.由于头颈部肿瘤早期诊断率低,局部复发和远处转移率高是其治疗失败的主要原因.因此,建立一种方便、安全、微创、重复性好、敏感度和特异度高的诊断及监测方法显得尤为重要.目前,基于生物标记物——循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)预测肿瘤预后及指导个体化治疗是恶性肿瘤研究的热点.ctDNA是肿瘤患者外周血中存在的无细胞状态的胞外DNA,可通过无创的形式获得,且重复获取容易,可动态评估肿瘤情况,并能克服肿瘤的异质性偏倚.尽管其在血浆中含量较低,但随着检测技术的进步,尤其是二代测序的广泛运用大大增加了其检出率.头颈部肿瘤中运用ctDNA开展的相关研究提示,ctDNA在早期诊断、疗效评估、病情监测及预后判断都有重要意义,可能为肿瘤个体化治疗提供分子学依据.虽然ctDNA在肿瘤的诊断、疗效评估、预后监测及个体化治疗等方面取得了长足的发展,但ctDNA在头颈部肿瘤中的研究还处于初步阶段,还需基础研究、临床资料、生物信息技术以及多中心多领域的共同合作来为头颈部肿瘤的诊治提供可靠的证据.
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应用第二代测序对一个范可尼贫血家系进行基因突变检测和产前诊断
目的 对一例范可尼贫血(Fanconi anemia,FA)先证者在母亲再次怀孕时采用第二代测序技术结合Sanger测序验证的方法进行快速诊断,并应用于产前诊断.方法 采用全基因外显子组高通量测序方法,分析全基因组外显子数据,在FA相关基因中发现FANCA基因有两个低频致病突变,随后对可疑致病突变进行Sanger测序验证,再对孕母抽取羊水,细胞培养并提取基因组DNA,对FANCA基因做突变检测.结果 检测到先证者在FANCA基因中携带母源性c.989_995del (p.H330LfsX2)和父源性c.3971C＞T(p.P1324L)突变,胎儿与先证者均携带此两种突变.结论 应用第二代测序技术对一例范可尼贫血患者进行快速亚型分型及基因突变检测,加快了对该患者家系再次生育的产前诊断速度.
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人体口腔微生物宏基因组的研究进展
人体生态环境中共生着数量庞大的微生物群落,被誉为人体第二基因组.口腔微生物与口腔及全身的健康和疾病有着密切的联系,新一代高通量基因芯片和第二代测序技术的涌现让人们对口腔微生物有了更全面的了解.本文就微生物宏基因组研究技术、口腔微生物宏基因组及其与口腔和全身疾病防治的新进展进行综述.
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应用Ion Torrent PGM TM平台检测中国汉族124个身份鉴定SNPs
目的：应用IonTorrent PGMTM测序平台检测中国汉族群体124个身份鉴定SNPs（individual identiifcation SNPs，IISNP）的多态性信息。方法采用Ion AmpliseqTM Library试剂盒对中国汉族130个无关个体样本及2个家系共8个个体的124个SNPs（90个常染色体SNPs和34个Y染色体SNPs）进行复合扩增，在Ion Torrent PGMTM测序平台上检测。结果中国汉族130个无关个体应得14148个SNP分型，其中软件给出分型结果14086个，正确14085个（99.9929%），分型偏倚1例（0.0071%）。软件未报SNP分型62例，需人工校正分析。在90个常染色体SNPs中，MP值高为0.8173（rs740910），低为0.3480（rs2831700），CMP为6.8984×10-34；DP值高为0.6520（rs1355366），低为0.1827（rs727811），CDP为0.9999999999999999999999999999999993102，高于22个STRs的CDP；PE值高为0.2781（rs1058083），低为0.0073（rs1024116）， CPE为0.9999996167，低于22个STRs的CPE。在34个Y-SNPs中，72个中国汉族男性无关个体共观察到8种单倍型。家系样本分型结果未发现突变，均符合遗传规律。结论124个身份鉴定SNPs在中国汉族群体中具有良好的遗传多态性，是理想的个体识别遗传标记。IonTorrent PGMTM平台在法庭科学领域有较好的应用价值。
