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应用变性高效液相色谱检测马凡综合征原纤维蛋白1突变
目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)结合DMA测序法检测分析马凡综合征(MFS)原纤维蛋白1(fibrillin-1)基因(FBNI)突变状况.方法 提取22例MFS患者全血DMA,PCR增扩FBNI的65个外显子,用DHPLC筛查DNA突变,对DHPLC图形异常的PCR产物用DNA测序分析突变分布.结果 在9例MFS患者FBNI中发现10种突变.其中有4种错义突变[5015G>C(C1672S)、5309G>A(C1770Y)、7241G>A(A2414c)与7769G>A(C2590Y)],4种无义突变[3295G>T(E1099X)、4307in8TCGT(G1441X),4621C>T(R1541x)与8080C>T(A2694x)],2种剪切位点突变(IVS29+4A>T与IVS50+1G>A).结论 DHPLC结合DNA测序法是一种快速有效的FBNI突变检测法,可用于MIFS的基因诊断.
关键词： 马凡综合征 原纤维蛋白-1 基因突变 变性高效液相色谱分析 -
利用目标基因测序技术发现马方综合征FBN1新突变
目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对马方综合征(Marfan syndrome,MFS)患者的原纤维蛋白-1(fibrillin-1,FBN1)基因进行突变筛查,探讨MFS与FBN1基因突变的关系.方法:提取5例MFS患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术(北京迈基诺公司),设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用illumina hiseq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证.结果:设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段.5例患者目标区域平均测序深度为173.85 ～ 280.73,97.10％ ～ 98.00％目标区域＞4×覆盖度.经过数据分析及Sanger测序验证,发现1个新的无义突变c.5968 C＞T(p.Gln1990X).结论:本研究所建立的GenCap目标基因捕获技术结合illumina hiseq2000第二代测序技术成功的发现了FBN1的新突变.该方法快速而有效,可以使我们对MFS分子病因学有更好的认识.
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马方综合征患者原纤维蛋白-1基因新发突变分析
目的 对17例马方综合征(Marfan syndrome,MFS)患者以及其中2例患者的家系成员的原纤维蛋白-1(fibrillin-1,FBN1)等14个基因进行突变筛查,探讨MFS与FBN1等基因突变的关系.方法 提取17例患者以及其他43例家系成员静脉血全基因组DNA.应用PCR技术对样品DNA进行扩增,采用基因芯片捕获目标基因,然后采用高通量测序仪进行测序.本研究的目标基因为ACTA2、CBS、FBN1、FBN2、MYH11、COL3A1、SMAD3、TGFBR1、TGFBR2、MYLK、MSTN、COLA2、TGFB2和SLC2A10等14个基因.将测序结果与数据库(NCBI dbSNP, HapMap, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)进行比对,并对找出的可疑突变进行注释、筛选.后对发现的基因突变采用Sanger法验证.结果 在17例MFS患者中发现了11例患者携带10种FBN1基因突变和1种激动蛋白α2(actin alpha2,ACTA2)基因突变,其中8种FBN1基因突变和1种ACTA2基因突变为新的基因突变,另外2中突变为已报道突变.对1种FBN1基因新发突变进行了家系验证,结果表明该突变在家系中与MFS疾病共分离.结论 FBN1基因的第59外显子的错义突变c.7280G>A是MFS新的致病突变.另外8种新发现的基因突变可能是MFS的致病突变.
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雌激素上调体外培养的子宫肌瘤平滑细胞中原纤维蛋白-1的表达
目的 探讨卵巢激素是否影响体外培养的子宫肌瘤平滑肌细胞中(Fibrillin-1, FBN-1) Mrna和蛋白的表达.方法 10份子宫肌瘤及同源正常子宫平滑肌组织标本在术中被采集,游离的子宫肌瘤平滑肌细胞及同源正常子宫平滑肌细胞在含有10%的胎牛血清DMEM培养基中培养.在细胞达到70%融合时继续用无血清培养基培养48 h,然后加入递增剂量的17β雌二醇(17-β estrodioal, E2)(0、0.1、1、10 ng/ml)或E210 ng/ml联合加入递增剂量的孕激素(0、1、10、100 ng/ml)继续培养48 h.采用实时荧光定量PCR、Western blot及荧光免疫组织化学方法探查FBN-1 Mrna和蛋白在体外培养的子宫肌瘤平滑肌细胞中的表达.结果 免疫荧光组织化学染色显示FBN-1在子宫肌瘤平滑细胞及正常子宫平滑肌细胞中均有表达;E2呈剂量依赖性增加子宫肌瘤平滑细胞中FBN-1 Mrna和蛋白的表达,尤其在E2浓度增加为10 ng/ml时,与对照组相比差异显著(P＜0.05, P＜0.01);而在E2联合不同剂量的孕激素的情况下对子宫平滑肌瘤细胞FBN-1 Mrna 和蛋白表达无影响.结论 雌激素增加体外培养的子宫肌瘤平滑细胞中FBN-1 Mrna 和蛋白的表达.
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晶状体异位的分子遗传学研究进展
晶状体异位(ectopia lentis)是由于先天性、外伤或病变等原因,使得晶状体悬韧带缺损或破裂引起悬挂力减弱所致.晶状体异位大致可以分为3类:①外伤性晶状体异位;②自发性晶状体异位;③遗传性晶状体异位.遗传性晶状体异位属于结缔组织疾病,既有常染色体显性遗传,也有常染色体隐性遗传.一般认为,遗传性晶状体异位的可能原因是编码原纤维蛋白-1的FBN1基因突变.一些与FBN1结构相似、功能密切相关的基因如FBN2、FBN3、LTBP和FBNL等也可能与晶状体异位有关,尽管目前尚无直接关联的研究报道,但这些基因突变与FBN1突变引起的某些症状相似.某些系统性疾病如Marfan综合征、高胱氨酸尿症和Weil-Marchesani综合征等也都伴发晶状体异位.有关FBN1基因突变的动物模型研究尚处于初级阶段.
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Marfan综合征和相关微纤维病理研究进展
Marfan综合征(Marfan syndrome,MFS)是一种涉及全身结缔组织的常染色体显性遗传性疾病,它是由FBN1基因突变造成的,主要累及眼、骨骼与心血管系统.原纤维蛋白(fibrillin-1,FBN1)是10nm～12nm微纤维的主要组成成分,FBN1除了对一些组织有固位作用外,还在弹性蛋白的前体与弹性纤维形成的过程中扮演着重要角色.自从发现FBN1基因突变以来,一直未见有突变热点的报道,然而,对于那些严重的Marfan综合征及新生儿患者来说,FBN1基因突变多集中在第23到32号外显子之间.FBN2基因与FBN1基因高度同源,FBN2基因突变所造成的表型为先天性挛缩性蜘蛛指(趾)征.另外,原纤维蛋白-1的突变在一些其他相关结缔组织疾病,例如单纯晶状体脱位,家族性主动脉瘤,类Marfan骨骼畸形中亦.发现,因此可以认为MFS是一系列微纤维病理改变中的一种类型.目前对微纤维球形结构与功能的理论一直不全面,本文将全面阐述Marfan综合征与相关微纤维病理改变的分子遗传学研究进展.
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中国汉族两个马凡综合征家系FBN1基因的一个新插入突变和一个复发点突变
目的:明确两个中国北方汉族马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)家系的临床特点,并对其进行基因诊断.方法:对两个家系进行家系调查和系谱分析,应用聚合酶链式反应-DNA测序方法对原纤维蛋白1基因(Fibrillin-1,FBN1)的所有外显子进行测序.应用Swiss-model、Polyphen-2和SIFT软件对发现的变异位点进行功能预测.结果:两个家系均呈常染色显性遗传特点,在家系1患者中发现一个新的插入突变,即第13外显子1691位碱基处插入碱基A(1691 ins A),导致蛋白在第571位氨基酸处翻译提前终止.此外,在家系2患者中发现一个已知的点突变,即第27外显子第3463位碱基由G变为A (3463 G＞A),导致第1155位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺.这两个变异位点在家系的健康人及50例健康对照中均未出现.功能预测发现这两个变异位点均可能会影响FBN1蛋白的结构或功能.结论:在两个MFS家系中发现一个新插入突变位点(1691 ins A)和一个已知点突变位点(3463 G＞A),为扩大FBN1基因的突变谱及进一步阐明FBN1基因突变在MFS中的作用提供理论依据.
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马凡综合征FBN1基因的一个全新突变
目的:检测1例马凡综合征(MFS)患者的原纤维蛋白-1(FBN1)基因,探讨其基因突变.方法:利用聚合酶链反应(PCR),对1例符合"根特标准"的MFS患者FBN1基因65个外显子中的9个(24～32)进行扩增,并直接测序.结果:在该MFS患者的第24外显子检测到新突变3069GT,该突变以往无报道.结论:该患者FBN1基因第24外显子存在点突变3069GT,可能为该MFS患者的发病原因.
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NGS和MLPA技术检测2例马凡综合征患者FBN1基因缺失突变
目的 对2例马凡综合征(Marfan's syndrome,MFS)患者的原纤维蛋白-1基因(FBN1)进行突变检测.方法 提取患者的外周血全基因组DNA,用第二代测序技术(NGS)和多重连接探针扩增技术(MLPA)对FBN1进行突变筛查,对这2种方法提示有拷贝数异常的外显子进行PCR和DNA Sanger测序以证实突变.结果 NGS和MLPA技术检测均显示1例患者有18号外显子缺失突变,另1例患者其56号外显子有缺失突变.经PCR和Sanger测序证实前者18号外显子及其两侧翼区有大片段缺失c.2114-2357_2167+747de13158bp,后者第56号外显子及其内含子有9 bp的缺失突变c.6864_c.6871+1delCTGTGTAGG.结论 NGS和MLPA技术有助于筛查基因组缺失突变,但仍需借助Sanger测序等方法验证.
关键词： 马凡综合征 原纤维蛋白-1 基因突变 第二代测序技术 多重连接探针扩增技术 -
马凡综合征FBN1突变的一个家系分析及产前诊断
目的 对一马凡综合征(Marfan's syndrome,MFS)个例进行原纤维蛋白-1基因(FBN1)突变分析并对该家系的1例MFS孕妇进行产前诊断.方法 提取先证者及其家族成员外周全血基因组DNA,先证者羊水细胞DNA和培养后羊水细胞的RNA.用PCR和DNA双向测序技术检测存在于FBN1外显子中的潜在突变.RT-PCR扩增RNA检测所发现突变的相应外显子并进行基因测序.结果 发现该先证者FBN1基因外显子23错义突变c.2785A＞ C(p.Thr929Pro),其患MFS的父亲和哥哥发现同样突变.该家族其他表型正常的成员该位点未发现突变.胎儿羊水细胞的DNA与羊水培养细胞RNA均未发现该位点的突变.结论 FBN1错义突变c.2785A＞ C(p.Thr929Pro)为该家族的致病原因,该MFS孕妇的胎儿未遗传该FBN1的致病突变.
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腹主动脉瘤组织原纤维蛋白-1表达水平及其对患者生存结局的影响
目的 探讨腹主动脉瘤组织原纤维蛋白-1(FBN1)表达水平及其对患者生存结局的影响.方法 收集45例腹主动脉瘤(AAA)患者主动脉瘤组织和29例正常腹动脉血管壁组织,免疫组织化学染色检测组织基质金属蛋白酶(MMP9)、FBN1蛋白表达定位,蛋白质免疫印迹法检测组织FBN1、MMP9蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测组织FBN1、MMP9 mRNA表达水平.对45例AAA患者进行随访,分析FBN1表达与患者病理资料及生存结局的关系.结果 FBN1、MMP9主要表达于动脉瘤组织巨噬细胞或平滑肌细胞,主动脉瘤组织FBN1、MMP9蛋白阳性表达率86.7%、93.3%均高于正常动脉壁组织34.5%、48.3%(χ2=21.467,19.450,P<0.001).主动脉瘤组织FBN1、MMP9 mRNA相对表达量分别为(1.89 ±0.19)和(2.29 ± 0.31),正常动脉壁组织分别为(0.79 ±0.15)和(1.32 ±0.12),主动脉瘤组织FBN1、MMP9 mRNA相对表达量高于正常动脉壁组织(t=26.317,t=16.061,P<0.001),差异有统计学意义;主动脉瘤组织FBN1、MMP9蛋白表达量分别为(1.08 ±0.11)和(1.02 ±0.10),正常动脉壁组织分别为(0.29 ±0.06)和(0.39 ±0.07),主动脉瘤组织FBN1、MMP9蛋白表达量高于正常动脉壁组织(t=35.376,t=19.548,P<0.001).对照组FBN1与MMP9表达无相关性(P>0.05),AAA组FBN1与MMP9表达呈成正相关(r=0.861,P<0.05),差异有统计学意义.主动脉瘤破裂及瘤体直径>8.0 cm患者FBN1表达水平高于瘤体直径≤8.0 cm者,差异有统计学意义(P=0.047).FBN1阴性患者5年生存率为87.2%,FBN1阳性患者5年生存率为48.1%,FBN1阴性组5年生存率高于阳性组(χ2=17.081,P<0.05).结论 腹主动脉瘤组织FBN1表达显著升高,FBN1表达越高,患者生存率越低,FBN1可以作为AAA患者生存结局的评估指标之一.
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Marfan综合征FBN1基因新的剪接位点的置换突变
目的 对Marfan综合征(MFS)患者的原纤维蛋白-1基因(FBN1)进行突变筛查,探讨MFS患者新的FBN1突变.方法 应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱法(DHPLC)对1例MFS患者FBN1的65个外显子进行突变筛查,对DHPLC图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位点及性质.用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)进一步证实突变.结果 发现1种新的FBN1剪接位点的置换突变(Intron29+4A＞T).结论 FBN1的Intron29+4A＞T可能为该MFS患者的发病原因.
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原纤维蛋白-1基因多态性与主动脉夹层关系研究进展
主动脉夹层是高度致命的血管疾病,主要组织病理学特征是平滑肌细胞凋亡和细胞外基质降解过程的中膜退化.主动脉夹层的发生与细胞外基质代谢平衡有关;原纤维蛋白-1是细胞外基质微纤维的主要成分,在人体弹性和非弹性结缔组织中提供结构支撑作用,参与血管重塑过程;这些结构变化由蛋白酶介导的细胞外基质破坏、信号通路改变和基因表达改变引起,对主动脉壁功能特性有重要影响.目前,主动脉夹层主要筛查方法包括主动脉造影、心脏超声、主动脉CT等影像学检查,其中主动脉造影为诊断的金标准.单核苷酸多态性作为遗传学标记,可预测疾病的发生.了解导致主动脉夹层的遗传机制对有效预防和治疗有重要作用.本文就原纤维蛋白-1基因多态性与主动脉夹层关系的研究进展作一综述.
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马方综合征相关FBN1突变的研究进展
马方综合征是一种结缔组织遗传缺陷疾病,病变累及全身各个系统.研究发现FBN1基因突变是导致马方综合征的一个重要原因,FBN1基因编码原纤维蛋白1,并参与构成弹性纤维,该基因的多种突变会导致其蛋白的组装和转运障碍,进而影响全身的结缔组织.携带FBN1突变的多种小鼠和多类人群均表现出马方综合征的典型特征,提示FBN1突变与马方综合征的发生联系密切.本文将就FBN1的基因突变与马方综合征之间的联系以及相关研究进展进行综述.
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腹股沟直疝及斜疝患者腹横筋膜原纤维蛋白-1、转化生长因子β1、类赖氨酰氧化酶1的表达研究
目的 比较原纤维蛋白-1(Fibrillin-1)、转化生长因子β 1(TGFβ1)及类赖氨酰氧化酶1(LOXL1)在腹股沟直疝及斜疝患者腹横筋膜组织的表达,探讨腹股沟直疝的发病机制.方法 用免疫组化和Western blot方法检测在我院行疝修补术患者(直疝19例,斜疝23例)腹横筋膜组织中Fibrillin-1、TGFβ 1及LOXL1的表达情况.并对两者相关性进行分析.结果 腹股沟直疝患者腹横筋膜组织Fibrillin-1、TGFβ 1及LOXL1的含量显著低于斜疝患者(P＜0.05);直疝腹横筋膜Fibrillin-1与TGFβ 1(P＜0.05),LOXL1与TGFβ 1的表达呈正相关(P＜0.05).结论 腹股沟直疝患者腹横筋膜组织Fibrillin-1、TGFβ 1及LOXL1存在异常表达,并且相互作用共同参与了腹股沟直疝的发生.
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29例汉族马凡综合征患者的FBN1基因突变分析
目的 对29例汉族马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)患者的原纤蛋白-1(fibrillin-1,FBN1)基因进行突变筛查,探讨MFS与FBNl基因突变的关系. 方法 提取29例患者外周血全基因组DNA,应用PCR技术对FBN1的65个外显子进行扩增,应用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)对患者FBN1的65个外显子进行突变筛查,对DHPLC检测出图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位点和类型. 结果 在12例MFS患者中发现12种FBNl突变.其中有8种为新的突变,分别为2359A＞T( S787C)、3380G＞T( GH27V)、4151T＞C( M1384T)、4244G＞A( C1415Y)、607l G＞T( C2024F)、IVS2+1G＞T、IVS37+5G＞A和7970C＞G+7971delC.另外4种为已报道突变,包括3037G＞A( G1013R)、6049T＞C(C2017R)、4429G＞T( E1477X)和4930C＞T( R1644X). 结论 FBN1基因突变可能是12例MFS患者的致病因素.
关键词： 马凡综合征 原纤维蛋白-1 基因突变 变性高效液相色谱分析 -
原纤维蛋白-1和弹性蛋白在女性盆腔器官脱垂患者阴道前壁的表达及意义
目的 探讨原纤维蛋白-1(Fibrillin-1)和弹性蛋白(Elastin)在女性盆底器官脱垂(POP)患者阴道前壁结缔组织中的表达及与疾病发生的关系.方法 选择资料完整的90例因POP行手术治疗患者的阴道前壁组织标本为观察组,其中Ⅱ°脱垂30例,Ⅲ°脱垂30例;同期选30例非POP患者的阴道前壁组织为对照组.采用免疫组化法和逆转录-PCR(RT-PCR)法检测两组Fibrillin-1和Elastin的表达.结果 Fibrillin-1和Elastin在观察组的表达均明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).Fibrillin-1和Elastin的表达在观察组Ⅱ°脱垂及Ⅲ°脱垂中的表达差异有统计学意义(P＜0.05).Fibrillin-1和Elastin在表达上呈正相关(r=0.957,P＜0.01).结论 Fibrillin-1表达的减少导致Elastin的表达减少,从而引起了盆底弹性纤维组织的破坏及缺失,其可能参与了盆底器官脱垂的发生、发展.
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四例马凡综合征患者的FBN1基因突变分析及产前诊断
目的 对4例马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)患者进行原纤维蛋白-1基因(fibrillin-1,FBN1突变检测及产前诊断,为患者提供病因诊断和遗传咨询.方法 应用PCR扩增和DNA测序对4例典型的MFS患者进行FBN1基因筛查.确定突变类型后,于孕18～20周穿刺抽取羊水,抽提DNA,PCR扩增FNB1基因,对PCR产物进行双向测序.结果 例1 FBN1基因第46内含子的+1位碱基发生置换(IVS46+1G＞ A)；例2第35外显子的4453位碱基发生错义突变c.4453T＞G(Cys1485Gly)；例3第21外显子2585位碱基发生错义突变巴2585G＞A(Cys862Tyr)；例4第28外显子3536位碱基A缺失c.3536 delA.c.4453T＞G(Cys1485Gly)、c.2585G＞A(Cys862Tyr)和c.3536 delA为新突变.4例胎儿羊水的标本也分别检测到IVS46+1G＞A、c.4453T＞G(Cys1485Gly)、c.2585G＞A(Cys862Tyr)和c.3536 delA突变.结论 FBN1基因筛查可以检测出患者及其家系中胎儿的突变位点和类型,具有明确的诊断价值,有助于遗传咨询.
关键词： 马凡综合征 变性高效液相色谱技术 原纤维蛋白-1 基因突变 产前诊断 -
马凡综合征两种新的原纤维蛋白-1基因突变
目的对9例马凡综合征(Marfan syndrome, MFS)患者的原纤维蛋白-1(fibrillin-1, FBN1)基因进行突变筛查,以发现新的 FBN1基因突变.方法应用变性高效液相色谱法对MFS患者 FBN1基因65个外显子中的35个进行突变筛查,对变性高效液相色谱图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位置及性质,并用等位基因特异性PCR以及限制性片段长度多态性分析等方法进一步证实突变.结果在两例MFS患者中发现两种新的 FBN1基因突变.其中一种为第34外显子4307～4308位4个碱基TCGT的插入突变(4307insTCGT),另一种为第43外显子5309位的点突变5309G>A.结论FBN1基因移码突变(4307insTCGT)与点突变(5309G>A)分别是这两例MFS患者的发病原因.
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原纤维蛋白-1 mRNA和蛋白在子宫肌瘤组织中的表达
目的:探讨原纤维蛋白-1(fibrillin-1,FBN-1)mRNA和蛋白在子宫肌瘤组织中的表达及其与月经周期的关系.方法:50份子宫肌瘤及同源正常子宫平滑肌组织标本在术中被采集.根据月经周期及子宫内膜组织病理学检查分为增生期、分泌期及萎缩期.采用实时荧光定量PCR、Western blot分析及免疫组织化学方法检测FBN-1 mRNA和蛋白的表达.结果:免疫组织化学染色显示FBN-1在子宫肌瘤及正常子宫平滑肌组织的细胞外基质中均有较丰富的表达.FBN-1 mRNA和蛋白在增生期和分泌期中的子宫肌瘤组织中的表达均明显高于同源正常子宫平滑肌组织(P＜0.01,P＜0.05;P＜0.01,P＜0.05),而在绝经期中的子宫平滑肌瘤及正常子宫平滑肌组织的表达无明显差异.结论:FBN-1可能与子宫肌瘤的发生机制有关,并可能受激素调节的影响.
