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阿托伐他汀抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞的氧化应激反应
目的：探讨阿托伐他汀（Atv）对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响及保护作用、可能作用机制。方法 HUVECs 低糖培养贴壁后分为对照 A 组；持续性高糖 B0组、持续性高糖＋不同浓度药物（0.1、1.0、10.0μmol/L Atv）B1～B3组；波动性高糖C组。高糖干预、药物培养24 h 后检测超氧化物歧化酶（SOD）活性及一氧化氮（NO）含量；细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞凋亡率；RT-PCR检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶NOX4和NOX2/gp91phox亚基的表达。所有计量数据采用均数±标准差（ x?s ）表示，SPSS 17.0软件处理分析。结果（1）与对照组相比，高糖各组细胞增殖均降低（CCK-8 D450值：B0组0.74±0.085 vs. A组1.20±0.045，P＜0.01；C组0.56±0.083 vs. A组1.20±0.045，P＜0.01），阿托伐他汀可改善高糖对 HUVECs 增殖的抑制作用，呈浓度依赖性。（2）与对照组比较，高糖组NO含量及SOD活性明显降低、NOX4 mRNA及NOX2/gp91phox mRNA的表达升高，细胞凋亡率显著增高。波动性高糖组变化趋势更明显[早期凋亡率：B0组（23.48±0.73）%vs. C组（27.33±0.89）%， P＜0.01]。（3）阿托伐他汀可明显升高持续性高糖诱导的SOD活性及NO的释放，减少细胞凋亡，抑制NOX4 mRNA及NOX2/gp91phox mRNA表达的增加幅度，具有明显的浓度依赖性。结论持续性高糖与波动性高糖对内皮细胞均有损伤作用，其损伤作用可能是通过氧化应激作用来实现的，波动性高糖较持续性高糖对内皮细胞的损伤作用更大。不同浓度的Atv对持续性高糖诱导的内皮细胞损伤有保护作用，呈浓度依赖性。
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波动性葡萄糖对胰岛β细胞INS-1的影响
目的 探讨波动性葡萄糖对培养的胰岛β细胞株INS-1细胞的损伤机制.方法 实验分5组.对照组:葡萄糖浓度为5.5 mmol/L;持续高糖组:葡萄糖浓度为16.7 mmol/L;波动性高糖组:16.7mmo/L葡萄糖培养2 h后更换葡萄糖浓度为5.5 mmo/L,继续培养3 h,每天重复3次,夜间9 h维持在5.5 mmo/L匍萄糖的培养基中;N-乙酰半胱氨酸(NAC,1.0 mmo/L)+高糖组;NAC+波动性高糖组.流式细胞仪检测活性氧簇(ROS)的水平;四氮唑蓝定量检测细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的活性;同时检测还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的含量.结果 干预72 h后,对照组、高糖组、波动性高糖组、NAC+高糖组和NAC+波动性高糖组细胞的ROS活性分别为37.77±2.31、86.97±7.97、124.27±10.04、60.92±2.61和51.47±3.36;G6PD活性分别为1.25±0.03、1.09±0.02、1.03±0.01、1.12±0.02和1.21±0.01;NADPH含量分别为(0.123±0.003)mmoVmg prot、(0.112±0.004)mmol/mg prot、(0.099±0.002)mmol/mg prot、(0.116±0.005)mmol/mg prot和(0.120±0.002)mmol/mg prot.波动性高糖组细胞ROS活性较单纯高糖组显著增加(P＜0.01),G6PD活性和NADPH含量较单纯高糖组显著减少(P＜0.01);加NAC共孵育使细胞的变化程度减小.结论 波动性高浓度葡萄糖使培养的INS-1细胞氧化应激水平增高,其机制可能是由于抗氧化酶G6PD活性降低导致了氧化还原的失衡.
关键词： 胰腺β细胞 活性氧 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 波动性高糖 -
利拉鲁肽改善波动性高糖诱导的内皮细胞氧化损伤的研究
目的 探讨利拉鲁肽对波动性高糖诱导的内皮细胞氧化损伤的影响及潜在机制. 方法 分离培养人脐静脉内皮细胞,分为正常葡萄糖对照(NC)组、持续性高糖(HG)组、波动性高糖(FG)组、高渗对照(HC)组、FG+利拉鲁肽(Lira)组、FG+ Lira+ Exendin(9-39)组和Exendin(9-39)组,各组均干预4d.采用流式细胞仪检测细胞内活性氧簇(ROS)水平和细胞凋亡比率,采用Western blot检测活化Caspase-3蛋白水平.结果 与NC组相比,HG、FG组ROS水平升高[(129.4±4.1)％ vs 100％;(130.5±1.2)％ vs 100％,P＜0.05],细胞凋亡比率增加[(21.6±1.7)％vs(14.8±3.9)％;(25.1±5.8)％ vs(14.8±3.9)％,P＜0.05],FG组活化Caspase-3蛋白水平升高[(223.6±2.4)％ vs 100％,P＜0.05].与FG组相比,FG+ Lira组ROS水平降低[(109.8±4.3)％ vs (133.2±1.9)％,P＜0.05],细胞凋亡比率降低[(17.3±3.9)％ vs (26.5±4.2)％,P＜0.05],活化Caspase-3蛋白水平降低[(110.3±6.4)％ vs(223.6±2.4)％,P＜0.05].添加Exendin(9-39)可部分消除FG+ Lira组的上述效应. 结论 利拉鲁肽抑制波动性高糖诱导的内皮细胞氧化损伤,其作用至少部分是呈GLP-1受体依赖性的.
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胰升血糖素样肽-1改善波动性高糖诱导大鼠胰岛细胞增殖功能机制的研究
目的 研究胰升血糖素样肽-1 (GLP-1)对波动性高糖诱导大鼠胰岛细胞增殖功能的影响及机制. 方法 将获取的原代胰岛细胞分为5组,即正常葡萄糖(5.5 mmol/L)组、恒定高糖(30.0 mmol/L)组、波动高糖(每24 h轮换培养于5.5、30.0 mmol/L)组、恒定高糖+GLP-1 (100 nmol/L)组和波动高糖+GLP-1组.干预7d后检测细胞增殖活性、活性氧簇(ROS)、细胞周期及周期蛋白cyclinD1、p21、p27、Skp2的表达. 结果 GLP-1干预可降低波动性高糖诱导的细胞内ROS水平[(194.40±19.20)vs(406.78±18.40),P＜0.05],上调促细胞周期cyclinD1、Skp2表达,下调周期抑制蛋白p21、p27表达,使停滞在G0/G1期的细胞比例减少,改善细胞增殖活性[(1.38±0.09)vs(0.44±0.10),P＜0.05]. 结论 GLP-1可通过降低氧化应激水平及对不同细胞周期蛋白表达的调节改善波动性高糖抑制的胰岛细胞增殖活性.
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波动性高糖下血红素加氧酶1对INS-1细胞氧化应激的影响
目的 探讨波动性高糖下血红素加氧酶1(HO-1)对INS-1细胞氧化应激的影响. 方法 以体外培养的INS-1细胞为研究对象,分为正常对照组、持续性高糖组、波动性高糖组、钴原卟啉(CoPP)+波动性高糖组、锌原卟啉(ZnPP)+波动性高糖组.各组均干预72h,Western blot检测HO-1蛋白表达水平,流式细胞仪测定活性氧簇(ROS)水平,四氮唑蓝(MTT)法测定细胞活力. 结果 波动性高糖组HO-1蛋白表达及ROS水平均显著高于持续性高糖组(P均＜0.01),波动性高糖组细胞活力显著低于持续性高糖组(P＜0.05)；与波动性高糖组相比,CoPP+波动性高糖组HO-1表达水平及细胞活力升高、ROS水平下降(P均＜0.05),而ZnPP+波动性高糖组呈现相反的变化趋势. 结论 波动性高糖较持续性高糖引起INS-1细胞产生更严重的氧化应激,在波动性高糖条件下,HO-1可能通过抗氧化应激对INS-1细胞发挥保护效应.
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丹参酮ⅡA抑制波动性高糖诱导的雪旺细胞凋亡的观察
目的 观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)对波动性高糖(IHG)所致的雪旺细胞(SC)凋亡的影响.方法 原代培养大鼠SC分为正常糖组(Con,5.6 mmol/L)、稳定性高糖组(HG,50 mmol/L)、IHG组(IHG,5.6～50.0 mmol/L)、渗透压对照组(mannitol)及IHG加不同浓度TanⅡA(0.1、1、10 μmol/L)组.检测线粒体膜电位(MMP)、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达. 结果 与Con组和HG组比较,IHG组MMP下降[(0.51±0.02) vs (1.42±0.08)vs(0.66±0.02)],细胞凋亡率增高[(5.01±0.26)％w(42.33±2.76)％vs (31.64±3.04)％](P＜0.05或P＜0.01)、线粒体细胞色素c(cyto-c)及凋亡诱导因子(AIF)水平降低,胞浆cyto-c及胞核AIF表达增高(P＜0.01);活化半胱天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)及caspase-3表达增高(P＜0.01).TanⅡA可升高MMP,减少细胞凋亡,抑制cyto-C释放及AIF转位,降低caspase-9及caspase-3的活化. 结论 TanⅡA能抑制SC凋亡,其机制是caspase活性降低,从caspase依赖性及非依赖性途径发挥作用.
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波动性高糖诱导大鼠胰岛β细胞凋亡的研究
近年来,胰岛细胞凋亡成为糖尿病研究的一大热点.葡萄糖毒性在糖尿病慢性高血糖状态下可诱导胰岛β细胞凋亡,但以往的研究多集中于慢性持续性高糖的作用,而对于更符合糖尿病患者实际情况波动性高糖的作用报道较少,且具体作用机制不清.因此,我们于2009年7月至2010年4月通过观测大鼠胰岛细胞株(Ins-1)细胞凋亡情况及检测氧化应激相关因子,探讨波动性高糖对胰岛β细胞凋亡的影响及可能机制.
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胰高血糖素样肽1通过调控葡萄糖调节蛋白78表达改善高糖及波动性高糖诱导的内皮细胞内质网应激及凋亡
目的 探讨胰高血糖素样肽1(GLP-1)对持续性高糖和波动性高糖诱导的内皮细胞内质网应激及凋亡的保护作用和机制.方法 将体外培养的入脐静脉内皮细胞(HUVECS)分成6组:正常葡萄糖对照组(5.5 mmol/L葡萄糖培养)、持续性高糖组(30 mmol/L葡萄糖培养)、波动性高糖组(5.5 mmol/L和30 mmol/L葡萄糖培养,每12h交替1次)、正常葡萄糖+10 nmol/L GLP-1组、持续性高糖+10 nmol/L GLP-1组、波动性高糖+10 nmol/L GLP-1组.后3组均先加入10 nmol/L GLP-1预处理半小时,后以相应浓度葡萄糖培养.各组细胞经处理48 h后,流式细胞仪测定细胞凋亡率,Western blotting法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达水平的变化.应用30 mmol/L高糖处理HUVECS不同时间(0、3、6、12、24、48 h),Western blotting法检测加入GLP-l前后GRP78蛋白表达水平的变化.两组间比较采用LSD-t检验,多组比较采用单因素方差分析.结果 将正常对照组的细胞凋亡率设定为1,波动性高糖组细胞凋亡率增至1.20±0.05,与对照组差异有统计学意义(F=45.086,P＜0.05);波动性高糖+GLP-1组细胞凋亡率降至0.87±0.01,与波动性高糖组差异有统计学意义(t=17.400,P＜0.05).与对照组(0h组,设定为1)相比,高糖处理HUVECS 3 h GRP78的表达量升高至1.62±0.48,差异有统计学意义(t=2.584,P＜0.05);6h达到高峰(2.82±0.59),与对照组差异有统计学意义(t=6.123,P＜0.05);12h后开始下降,高糖作用48 h下降至0.98±0.59,与对照组相比无统计学差异(t=0.378,P＞0.05).波动性高糖组GRP78的表达水平降至(0.77±0.04),与持续性高糖组(0.96±0.10)相比,差异有统计学意义(t=3.134,P＜0.05).结论 持续性高糖和波动性高糖均可引起内皮细胞发生内质网应激和凋亡,后者通过进一步抑制防御蛋白GRP78的表达,加重内质网应激;GLP-1可通过增加细胞内GRP78的表达改善内质网应激进而改善凋亡.
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二甲双胍对波动性高糖诱导的内皮细胞功能障碍的逆转作用及其机制
目的 探讨二甲双胍对波动性高糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其可能机制.方法 以体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象,分为6组:正常葡萄糖对照组、高渗对照组、持续性高糖组、波动性高糖组、波动性高糖+二甲双胍组以及波动性高糖+二甲双胍+化合物C组,各组均干预72 h.以硝酸还原酶法检测细胞上清液亚硝酸盐浓度代表一氧化氮(NO)产生水平；流式细胞仪分析测定细胞内活性氧簇(ROS)水平；Western blotting检测单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)、磷酸化AMPK(Thr-172,p-AMPK)及三磷酸鸟苷环化水解酶1(GTPCH1)的蛋白表达水平.组间比较采用单因素方差分析和Q检验.结果 (1)与正常葡萄糖对照组(100％)相比,波动性高糖组细胞内ROS水平增加[(222.4 ±62.0)％],NO水平下降[(70.3±7.1)％]；添加二甲双胍后ROS水平降低[(100.2±17.4)％],NO水平升高[(96.3±9.2)％]；添加AMPK抑制剂化合物C后ROS水平增加[(167.2±19.6)％],NO水平降低[(83.3±8.7)％].差异均有统计学意义(均P＜0.05).(2)与正常葡萄糖对照组相比,波动性高糖组p-AMPK[(1.72±0.08)比(2.34±0.09)]和GTPCH1[(4.07 ±0.17)比(7.83±0.56)]表达水平降低；添加二甲双胍后p-AMPK (2.72±0.22)和GTPCH1(10.24±1.05)表达水平增高；添加化合物C后GTPCH1表达水平降低(2.39 ±0.34).差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 二甲双胍可通过激活AMPK信号通路,上调GTPCH1表达,从而改善波动性高糖所致的内皮细胞功能障碍.
关键词： 二甲双胍 波动性高糖 内皮细胞 三磷酸鸟苷环化水解酶1 -
丹参酮ⅡA可改善波动性高糖诱导的大鼠乳鼠雪旺细胞氧化应激及凋亡
目的 研究丹参酮ⅡA对波动性高糖(IHG)诱导的大鼠乳鼠雪旺细胞(SC)氧化应激及凋亡的干预作用.方法 原代培养出生3~5 d的大鼠乳鼠SC,分为正常对照组(con组,5.6 mmol/L葡萄糖)、稳定性高糖组(HG组,50 mmol/L葡萄糖)、IHG组(每8小时交替培养于5.6及50.0 mmol/L葡萄糖)、渗透压对照组、α硫辛酸组(500μmol/L)及IHG加不同浓度丹参酮ⅡA组(0.1、1.0、10.0μmol/L).检测各组细胞凋亡率、氧化应激水平、凋亡相关蛋白及其mRNA表达.多组独立样本间比较采用单因素方差分析.结果 (1)与con组[(4.74±0.26)%]相比,HG组[(34.57±2.45)%]及IHG组[(40.17±2.33)%]细胞凋亡率明显增加(F=473.19,P<0.01),其中IHG组凋亡率明显高于HG组(t=3.70,P<0.01).与IHG组相比,丹参酮ⅡA组细胞凋亡率呈剂量依赖性下降(F=66.35,P<0.01).(2)与con组及HG组相比, IHG组SC内活性氧簇(ROS)及8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平升高(F=73.44、194.21,均P<0.01),bcl-2 mRNA及蛋白表达下降(F=54.99、151.88,均P<0.01),bax mRNA及蛋白表达上调(F=126.69、66.78,均P<0.01),caspase-3及多腺苷二磷酸聚合酶(PARP)活化增加(分别增加129%、18%及139%、56%,均P<0.01).(3)1.0、10.0μmol/L丹参酮ⅡA可降低IHG所致ROS及8-OHdG的升高(t=3.50~6.47,均P<0.05),下调bax蛋白及mRNA表达(t=3.59~5.39,均P<0.01),降低PARP及caspase-3的活化(分别降低42%、61%及13%、34%,均P<0.01),抑制SC凋亡(t=12.39、21.26,均P<0.01).结论 丹参酮ⅡA可通过降低氧化应激反应抑制IHG所致的大鼠乳鼠SC凋亡.
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波动性高糖对血管内皮细胞生存及凋亡的影响
目的 探讨波动性与持续性高糖对血管内皮细胞生存及凋亡的影响.方法 以人脐静脉内皮细胞为研究对象,通过MTT,AnnxenV-FTTC 检测细胞生存率及凋亡率观察,探讨波动性高糖(5.5或25 mmol/L)及持续性高浓度葡萄糖(25 mmol/L)对血管内皮细胞存活率及凋亡率的作用.结果 持续高葡萄糖条件下细胞生存率低于正常浓度,而波动性高糖条件下细胞生存率又低于持续高糖,凋亡率则相反.结论 波动性高糖较持续性高糖对血管内皮细胞具有更强的损伤效应,且是独立于持续性高糖之外的血管内皮细胞伤害因素.
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瑞舒伐他汀对波动性高糖诱导的血管内皮损伤的作用
目的 通过培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),构建糖尿病患者内皮细胞损伤模型,然后用瑞舒伐他汀干预以寻求一种保护内皮细胞、防治糖尿病心血管并发症的高效安全的新疗法.方法 选取活性较好的人脐静脉内皮细胞分成5组进行实验,分别为对照组(A组)、波动性高糖组(B组)、波动性高糖+瑞舒伐他汀(0.5μmol/L)组(C组)、波动性高糖+瑞舒伐他汀(5μmol/L)组(D组)、波动性高糖+瑞舒伐他汀(10μmol/L)组(E组).建立好波动性高糖损伤模型后,检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)及NO含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT- PCR 检测NOX4的mRNA的表达.结果 与对照组比较,波动性高糖组NO含量和SOD活性,及NOX4mRNA的表达明显减少; MDA含量,细胞凋亡率明显增高;与波动性高糖组相比,随着药物浓度的增加波动性高糖诱导的HUVEC细胞凋亡率及MDA含量呈递减趋势,SOD的活性,NO含量及NOX4mRNA的表达逐渐递增.结论 ①波动性高糖对内皮细胞有损伤作用;②波动性高糖对内皮细胞的损伤作用可能是通过其氧化应激作用来实现的;③不同浓度的瑞舒伐他汀对波动性高糖诱导的内皮细胞损伤有保护作用.
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洋参二醇皂苷对波动高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护效应研究
目的：探讨洋参二醇皂苷对波动高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护效应及其机制。方法以体外培养人脐静脉内皮细胞为研究对象，通过每24 h间替更换高糖型DMEM全培养基（葡萄糖浓度25 mmol／L）与低糖型DMEM全培养基（葡萄糖浓度5．56 mmol／L）构建人脐静脉内皮细胞血糖波动模型。实验分为5组，包括正常低糖组、稳定高糖组、波动高糖组（间替高糖／低糖）、洋参二醇皂苷低剂量组（0．04 mg／mL）、洋参二醇皂苷高剂量组（0.08 mg／mL）。细胞培养8d ，观察细胞形态学表现，MTT测定细胞成活率，取细胞培养上清液检测乳酸脱氢酶（ LDH）、一氧化氮（NO）、内皮素－1（ET－1）、可溶性细胞间黏附分子－1（sICAM－1）、肿瘤坏死因子－α（TNF －α）含量，细胞裂解液检测胞内超氧化物歧化酶（ SOD）活性和丙二醛（ MDA）含量。结果洋参二醇皂苷低、高剂量组细胞形态均较波动高糖组明显好转，细胞活性和细胞中SOD活性均明显高于波动高糖组（P均＜0．05），LDH漏出率和细胞中TNF－α、sICAM－1、ET－1、NO、MDA 含量均明显低于波动高糖组（P均＜0．05）。结论洋参二醇皂苷对波动高糖诱导的人脐静脉内皮细胞具有显著保护效应，其保护效应与其能够显著减轻葡萄糖波动诱导的氧化应激、炎症反应及细胞黏附分子的过度表达密切相关。
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波动性高糖对人脐静脉血管内皮细胞的损伤及其机制的研究
目的 观察波动性高糖在体外诱导人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的损伤作用,并探讨其机制.方法 以HUVEC为研究对象,体外培养至第三代,实验分为:A组为正常组(正常培养的细胞),B组给予恒定加入5.5mmol/L 葡萄糖(Glu),C组给予恒定加入7.8mmol/L Glu,D组给予每24h轮换加入5.5mmol/L/7.8mmol/L Glu,E组给予恒定加入14.5mmol/L Glu,F组给予每24h轮换加入5.5mmol/L/14.5mmol/L Glu,G组给予恒定加入20mmol/L Glu,H组给予每24h轮换加入5.5mmol/L/20mmol/L Glu各组分别与HUVEC孵育5d,测定各组细胞液中的细胞活力(MTT)指标.测定正常对照组、恒定性高糖组(E组和G组)及波动性高糖组(F组和H组)细胞上清液中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶活力(SOD)、一氧化氮(NO)的含量、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)含量及细胞凋亡率,并在显微镜下观察细胞形态变化.结果 培养液中SOD、NO的含量在波动性高糖组与恒定性高糖组均与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);培养液中MDA及ICAM-1的含量在波动性高糖组与恒定性高糖组均与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).波动性高糖与恒定性高糖均可导致HUVECs出现凋亡的形态学变化,波动性高糖组的凋亡率与恒定性高糖组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 (1)波动性高糖和恒定性高糖对人脐静脉血管内皮细胞均有损伤,且波动性高糖对其损伤更大.(2)波动性高糖体外诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的机制可能与其氧化应激水平更高,炎症反应加重及细胞凋亡率增加有关.
关键词： 人脐静脉血管内皮细胞 波动性高糖 氧化应激 炎症 细胞凋亡 -
人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及丙二醛、抗氧化因子合成与波动性高糖的影响
背景:研究表明波动性高血糖较持续性高血糖对血管内皮功能的损害可能更严重.目的:观察波动性高糖对人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及丙二醛、抗氧化因子合成的影响.方法:密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞.取经培养鉴定后的内皮祖细胞,细胞同化后分别给予5.5 mmol/L,20 mmol/L,5.5/20 mmol/L葡萄糖(5.5,20 mmol/L的葡萄糖培养液每8 h更换1次)及20 mmol/L甘露醇.干预72 h后,MTT法检测内皮祖细胞的增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;比色法测定培养液中丙二醛水平及超氧化物歧化酶活力.结果与结论:20 mmol/L和5.5/20 mmol/L葡萄糖作用72 h,内皮祖细胞增殖减少、凋亡率增高(P < 0.01),培养液中丙二醛水平增高、超氧化物歧化酶活力降低(P < 0.01),均以5.5/20 mmol/L葡萄糖作用明显(P < 0.01).说明波动性高糖较恒定性高糖更易抑制内皮祖细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与波动性高糖环境下氧化应激水平增高有关.
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核因子-κB 和 p53在波动性高糖致心肌细胞凋亡中的作用
将乳鼠心肌细胞分为对照组、高糖组、波动性高糖组以及波动性高糖＋NF‐κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸（PDTC）组，培养6天后进行心肌细胞的鉴定、心肌细胞活性、心肌细胞凋亡、NF‐κB和p53的蛋白表达的检测。结果显示，与高糖组相比，波动性高糖组的细胞存活率下降，凋亡率、NF‐κB和p53的表达增多。与波动性高糖＋PDTC组相比，波动性高糖组细胞存活率下降，凋亡率、NF‐κB和p53的表达增多。因此在波动性高糖条件下，NF‐κB和p53表达更易增多，NF‐κB可能通过p53介导心肌细胞凋亡。
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白藜芦醇对波动性高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞脂联素受体表达的影响
目的 探讨白藜芦醇( resveratrol)对波动性高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞脂联素受体(AdipoR1和AdipoR2)表达的影响及机制.方法 采用脂质体介导的方法将叉头转录因子O1(FoxO1)短发夹样RNA( FoxO1 shRNA)质粒载体稳定转染大鼠肾小球系膜细胞;波动性高糖(5.6 mmol/L或30mmol/L,每隔8h轮换)培养转染后的大鼠肾小球系膜细胞,并用白黎芦醇(20μmol/L)处理.以葡萄糖浓度( 5.6 mmol/L)培养的大鼠肾小球系膜细胞作为正常对照组(NG),将波动性高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞分为5组:波动性高糖组(IHG)、IHG+白黎芦醇组、IHG+FoxO1 shRNA转染组、IHG+白黎芦醇+FoxOlshRNA转染组、IHG+转染阴性对照组(shNC).培养72 h后,用荧光酶标仪检测各组大鼠肾小球系膜细胞内活性氧簇(ROS)水平；RT-PCR检测去乙酰化酶(Sirt1)、FoxO1、AdipoR1、AdipoR2 mRNA的表达,Western印迹检测FoxO1、磷酸化FoxO1( p-FoxO1)、AdipoR1和AdipoR2蛋白的表达.结果 (1)与NG组相比,IHG组Sirtl mRNA表达下降,p-FoxO1水平升高,转录活性降低,AdipoR1表达下降,ROS水平升高(均P＜0.05)；(2)与IHG组相比,IHG+FoxO1 shRNA转染组,FoxO1表达被抑制,AdipoR1表达更低,ROS水平更高(均P＜0.05)；(3)与IHG组相比,IHG+白黎芦醇组Sirt1 mRNA表达升高,p-FoxO1水平下降,转录活性升高,AdipoR1表达升高,ROS水平下降(均P＜0.05)；(4)与IHG+白黎芦醇组相比,IHG+白黎芦醇+FoxO1shRNA转染组,FoxO1表达被抑制,AdipoR1表达降低,ROS水平升高(均P＜0.05)；(5)各组间AdipoR2表达无统计学意义(P＞0.05).结论 (1)白藜芦醇能显著上调波动性高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞内AdipoR1的表达.(2)FoxO1在白藜芦醇调节AdipoR1表达中发挥重要作用.
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波动性高糖对胰岛β细胞增殖及Skp2-p27表达的影响
目的 探讨波动性高糖对INS-1细胞增殖、凋亡及对细胞周期进程的影响,并研究其可能的分子机制.方法 采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8)检测细胞增殖活性,流式细胞仪测定细胞周期及细胞ROS水平,Annexin-V/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡.应用Western印迹检测细胞周期调控蛋白p27及Skp2的表达水平.结果 (1)波动性高糖及持续性高糖均明显抑制INS-1细胞的生长,且波动性高糖对细胞增殖的抑制作用更为显著.(2)波动性高糖及持续性高糖均明显增加INS-1细胞的凋亡,且波动性高糖作用更为显著.(3)波动性高糖及持续性高糖能明显抑制细胞周期进程,使INS-1细胞周期更多滞留在G0/G1期,G2/M期与S期细胞比例下降,波动性高糖作用更显著.(4)波动性高糖及持续性高糖均能显著增强细胞周期调控蛋白p27的表达,同时减弱Skp2蛋白的表达水平.结论 波动性高糖较持续性高糖更能够抑制INS-1细胞的增殖和诱导凋亡,可能是通过减弱Skp2蛋白的表达水平,增加p27蛋白的活性,使细胞阻滞在G0/G1期,抑制细胞周期进程,从而减弱细胞的增殖活性.
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PERK-eIF2α-ATF4通路在波动性高糖损伤胰岛β细胞分泌功能中的作用
目的 旨在探讨内质网类似激酶(PERK)-真核细胞翻译启始子2α(eIF2α)-活化转录因子4(ATF4)通路介导的内质网应激在波动性高糖影响胰岛β细胞分泌功能中的作用.方法 评价波动性高糖对β细胞分泌功能的影响,并采用实时定量PCR及Western印迹等方法检测内质网应激因子的表达变化.结果 经过24和48 h孵育后,波动性高糖组(FH组)细胞同正常糖对照组(NG组)相比胰岛素分泌能力明显降低,而持续性高糖组(SH)和NG组相比无显著差别.经过72 h孵育后,FH组和SH组细胞分泌胰岛素能力均明显降低,FH组降低得更显著.细胞孵育72 h后,FH较SH组和NG组细胞内磷酸化的RNA激活蛋白激酶的PERK、eIF2α及ATF4水平均明显升高.结论 波动性高糖通过PERK-eIF2α-ATF4通路诱导内质网应激而损伤胰岛β细胞分泌功能,对胰岛β细胞而言较持续性高糖更具危险性,因此积极地预防和治疗波动性高血糖将成为糖尿病新的临床治疗方向.
关键词： PERK-eIF2α-ATF4通路 内质网应激 波动性高糖 胰岛β细胞 -
波动性高糖对人脐静脉内皮细胞炎症因子表达的影响
目的 研究体外波动性和持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)炎症因子表达的影响.方法 分别在正常葡萄糖(5.5 mmol/L,NG)、持续性高糖(25 mmol/L,PHG)、波动性高糖(5.5 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖每24 h交替,OHG)和波动性高渗环境(不加入葡萄糖,加入不同量甘露醇控制渗透压与波动性高糖组一致,OC)中连续培养HUVEC7d.采用ELISA法和实时定量PCR法分别检测HUVEC在不同血糖环境中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞间黏附因子-1(ICAM-1)中蛋白和mRNA的表达.结果 与NG组和OC组比较,发现持续性高糖可以显著升高HUVEC的IL-6、TNF-α和ICAM-1蛋白表达(P＜0.05),而波动性高糖可以进一步放大这种差异(P＜0.05).在mRNA水平,PHG组较NG组和OC组显著增加IL-6、TNF-α和ICAM-1表达(P＜0.05),而这一趋势在波动性高糖组为明显(P＜0.05).结论 持续性高糖可以显著增强HUVEC炎症反应,而波动性高糖进一步放大这一效应.
