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HPV-DNA在宫颈疾病中的检测价值分析
目的 讨论HPV-DNA在宫颈疾病中的监测价值.方法 采用二代杂交捕获技术分别检测577例宫颈疾病患者,并借助病理学镜检辅助确诊.结果 在上述病例中,HPV-DNA检验出慢性宫颈炎313例(阳性率54.13％)、宫颈上皮内瘤变164例(阳性率78.05％)、HPV亚临床感染92例(阳性率90.22％)、宫颈癌HPV高危型DNA的表达8例(阳性率100％).结论 HPV-DNA高危型检测对早期发现宫颈疾病具有临床意义.
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食管癌组织中HPV16型L2线性抗原基因的克隆及原核表达
目的通过聚合酶链方法,以特异引物,从感染人乳头瘤病毒的新鲜食管癌组织获得人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2保守区线性抗原片段的基因,并体外表达,获得具有抗原活性的原核表达蛋白,以探索研制低廉,方便及准确的人乳头瘤病毒感染的新型诊断试剂.方法在前人研究的基础上,经计算机检索,选定与食管癌高度相关的人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2 N端的一段基因,采用特异引物及聚合酶链方法从多例人乳头瘤病毒感染的食管癌组织DNA模板中,获得人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2保守区线性抗原片段的基因,经克隆入测序载体验证DNA大小及序列后,将HPV16 L2DNA保守区线性抗原基因片段克隆入高效原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,初步以Western-blot测定表达产物的抗原性:与乳头瘤病毒抗体及感染者血清的反应活性.结果以我们设计的特异引物,从两例人乳头瘤病毒感染阳性的食管癌组织DNA模板中能得到预期大小的PCR产物,并能插入预定的克隆载体中测序,所得基因的序列符合目的基因的序列,且两例组织所得的目的DNA序列完全一致,其插入大肠杆菌表达载体能获得表达,且表达产物具有抗原活性,能与商品化的乳头瘤病毒抗体及乳头瘤病毒感染患者的血清发生原抗体反应.结论从食管癌组织中能检出人乳头瘤病毒HPV16型晚期表达基因区L2特定片段的基因,该片段确具高度保守性.在大肠杆菌中表达此片段所获得的表达产物,有抗原活性,有望用于流行病学检查,预警人乳头瘤病毒感染相关的癌症发生.
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宫颈癌组织中HPV16E6序列多态性及同源性分析
目的:探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E6基因序列的多态性及同源性.方法: 采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E6,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而分析其同源性.结果: 50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例.含有HPV16型的标本34例中扩增出HPV16E6 25例.其中178位核苷酸变异较大,变异率为72%,其相应氨基酸均由天冬氨酸变为谷氨酸.结论: HPV16E6 DNA序列发生碱基替换的区域主要在氨基端94～241位,羧基端相对保守,未见变异.广东地区宫颈癌组织中HPV16E6的热点突变为Nt178.
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自然流产、无精症和先天愚型患者外周血染色体核型分析
目的:阐述自然流产、男性无精子症、先天愚型以及其它病症(畸形、肥胖等)与染色体变异的关系,以便做出及时、准确诊断.方法:人外周血淋巴细胞染色体G显带的检测.结果:受检594例中染色体异常58例(异常率9.73%).其中自然流产患者262例,异常18例(异常率6.87%);无精子症215例,异常26例(异常率12.09%);先天愚型32例,异常12例(异常率37.5%);其它病症(畸形、肥胖等)85例,异常2例(异常率2.35%).结论:染色体核型分析有助于自然流产、男性无精症和先天愚型的病因诊断.
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大连市儿童手足口病肠道病毒71型基因型别和毒力位点分析
目的 分析大连市引起儿童手足口病(hand-foot-mouth Disease,HFMD)的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)VP1基因特征,寻找与毒力相关的基因位点. 方法 用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对HFMD轻症和重症临床标本进行EV71的VP1全基因扩增,分析扩增产物同源性,并与各基因型代表株构建进化树,比对分析轻症和重症间EV71的VP1基因. 结果 扩增产物核苷酸和蛋白质序列与C4a亚型具有较高的同源性,在系统进化树上,与C4a亚型处于同一分支.轻症和重症EV71的VP1基因无共同差异位点. 结论 大连市HFMD病原体EV71为C4a亚型,EV71存在多种传播链,在VP1基因上未发现与毒力相关的基因位点.
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扬州地方株HPV16 L1基因的克隆及序列分析
目的:了解扬州地方株HPV16-L1基因结构特点,为研制HPV16疫苗奠定基础.方法:从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA,用PCR技术获得HPV16-L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析.结果:扬州地方株与德国标准株在核苷酸序列上有7处不同,其中4处由于核苷酸的改变,其编码氨基酸也相应发生变化,与标准株的同源性为99.7%;扬州地方株与中国株之间也存在1至2处核苷酸不同,但未造成氨基酸序列改变,其同源性为99.9%.结论:扬州地方株HPV16-L1基因与标准株、中国株之间均存在差异,但与后者的差异极小,未造成氨基酸改变.
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鼻咽癌患者鼻咽拭子中EB病毒LMP1基因C末端的变异及序列分析
目的 研究LMP1基因C端区在宁波地区鼻咽癌患者中的变异状况,并探讨其在鼻咽癌中所起的作用.方法 通过鼻咽拭子的方法采集鼻咽癌患者的病变黏膜上皮及分泌物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增鼻咽癌患者鼻咽拭子中的LMP1基因C末端,并对其进行序列分析.结果 30例鼻咽癌患者的鼻咽拭子标本中有28例显示出阳性条带,且都存在序列变异,而正常对照标本无一扩增得到,特异性为100.0%.28例阳性标本中有7例标本存在30 bp的缺失突变,缺失率为25.0%.结论 宁波地区的鼻咽癌鼻咽拭子中LMP1基因C端高变区30 bp的缺失型约占25.0%,不是主要流行型.
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β-防御素2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达
目的:探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽--β-防御素2的可行性.方法:采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素2(rBD2)基因片段,定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,重组质粒pShuttle-CMV-rBD2转化E.coli BJ5183-AD-1后,与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1发生同源重组,重组质粒pAdEasy-rBD2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装.将包装成功的腺病毒感染COS-7细胞,并建立SD大鼠腺病毒感染模型,进行β-防御素2多肽的体外和体内表达,采用Western blot与免疫组化方法检测其表达.结果:重组腺病毒表达载体构建成功,包含大鼠β-防御素2基因,滴度达到109PFU/ml,Western blot与免疫组化方法分别检测到β-防御素2在SD大鼠体外、体内的表达.结论:重组腺病毒载体能在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽--β-防御素2.
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人乳头状瘤病毒和p53基因及H-ras基因在喉癌细胞中的表达
目的:研究喉癌细胞p53基因、H-ras基因突变及其与人乳头状瘤病毒(HPV)感染的关系,探讨其在喉癌发生发展中可能起的作用.方法:采用分子生物学技术,包括聚合酶链反应、单链构型多态性分析、限制性内切酶长度多态性分析,及DNA序列分析等方法,对28例喉癌进行人乳头状瘤病毒、p53基因及H-ras基因检测.结果:28例喉癌中有50%在p53基因的第7～8外显子有突变,其中4例行DNA序列分析表明均有碱基替换、插入或丢失;而H-ras基因第12密码子的突变率仅3.57%;高危型HPV(HPV-16或-18)感染在喉癌细胞中有一定的特异性,且与p53基因突变有一定的相关性.结论:在喉癌的发生发展过程中高危型HPV感染和p53基因突变起着重要的作用,且两者之间可能存在某种内在的联系.
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A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达
目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒(HRSV)G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定.方法自行设计引物,利用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEM-T easy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),酶切鉴定后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定基因转录和蛋白表达.结果真核表达载体pcDNA3.1(+)G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变.转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到G基因有转录,Western blotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带.结论成功克隆A亚型HRSV G基因,并在真核细胞中获得表达.
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鼻咽癌患者外周血白细胞及血清中EB病毒DNA的检测
目的探讨鼻咽癌患者外周血白细胞及血清中EB病毒DNA的分布及其与鼻咽癌的关系.方法采用多聚酶链反应检测24例鼻咽癌患者(实验组)及10例头颈部其它部位肿瘤(对照组-1)和10例慢性鼻咽炎患者(对照组-2)外周血白细胞及血清中EB病毒的DNA.同时采用免疫酶法检测以上各组患者血清中EB病毒VCA-IgA抗体的效价.结果发现实验组中10例患者外周血白细胞中EB病毒DNA为阳性,阳性率为41.67%(10/24).对照组-1阳性率为10%(1/10),对照组-2患者外周血白细胞中EB病毒DNA均为阴性.实验组与对照组-2比较阳性率差异有显著性(P＜0.05).在以上三组患者血清中EB病毒DNA均为阴性,三组间无差异.实验组VCA-IgA与对照组-1,对照组-2分别比较阳性率其差异均有显著性(P＜0.01).结论有些鼻咽癌患者外周血白细胞中可检测出EB病毒DNA.血清中未能检测出EB病毒DNA.鼻咽癌患者外周血白细胞EB病毒DNA的存在与血清VCA-IgA的效价之间有一定的关系.
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宫颈癌组织中人乳头瘤病毒基因分型的研究
[目的]了解宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)的感染及其基因型的分布情况,并探讨人乳头瘤病毒感染及其基因型与癌肿类型的相关性.[方法]采用可检测23种HPV基因型的基因芯片方法分别检测200例宫颈癌组织的HPV基因型,计算宫颈癌组织中HPV及各基因型的感染率,比较HPV及其主要基因型与癌肿类型的关系.[结果]①200例官颈癌组织中HPV的阳性率为94.00%(188/200),其中鳞癌为95.86%(162/169),显著高于腺癌的80.00%(X2=9.73,P<0.01),而HPV16、HPV18型和HPV双重感染在鳞、腺癌中的阳性率差异无显著性.②200例宫颈癌组织中共检测到9种HPV基因型,分别为HPV16,18,45,33,58,59,73,31,56,均为高危型感染,其中HPV16常见,检出率达74.00%(148/200)、其次是HPV18,16.00%(32/200);200例宫颈癌组织中共检测到HPV双重感染24例,检出率达12.00%.[结论]HPV与宫颈癌的关系密切,HPV感染更常见于宫颈鳞癌.但HPV各基因型的分布与宫颈癌的类型无关;宫颈癌的HPV基因型呈多样性,且均为高危型感染,其中以HPV16型常见,其次是HPV18型,并存在一定数量的双重感染.
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A型流感病毒HA(H1N1)基因真核表达载体的构建及序列分析
[目的]构建A型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因真核表达载体,研究其作为DNA疫苗的免疫效果.[方法]从流感病人体内分离流感病毒(A/Guangdong/376/2001/H1N1),提取RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增HA基因,先将其克隆到pMD18TVector,进行序列测定和分析;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo),进行鉴定.[结果]获得一个核苷酸长度为1698bp的基因,编码565个氨基酸;同源性比较结果表明:和A/HongKong/1131/98(GenBank/NCBI:AF386775)有98%同源,序列分析表明有10个氨基酸出现变异;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN).[结论]HA基因真核表达载体的成功构建,可以进一步研究其免疫功能.
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鲍温样丘疹病组织中人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析
目的: 克隆生殖器鲍温样丘疹病(Bowenoid papulosis of the genetalia)组织中人乳头瘤病毒16型L1基因并进行序列分析.方法: 采用PCR法从10例生殖器鲍温样丘疹病标本中扩增获得人乳头瘤病毒16型(HPV16)的晚期基因L1,克隆入载体,并测序,分析其序列.结果: 与HPV16 L1标准型比较,发现10例L1标本的序列存在若干变异,并由此引起所编码的氨基酸亦发生变化.结论: 鲍温样丘疹病组织中HPV16 L1基因序列存在一定程度的变异,其变异的临床意义有待于进一步探讨.
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HPV-DNA分型检测及阴道镜检查ASCUS108例分析
目的 探讨HPV-DNA分型检测对TCT结果为ASCUS患者分流处理中的作用.方法 对108例TCT结果为ASCUS患者同时行HPV-DNA分型检测及阴道镜检查,以阴道镜病理检查结果为金标准,计算HPV在诊断宫颈病变中灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值.结果 HPV在诊断宫颈病变中灵敏度100%特异性26.6%,阳性预测值13.15%阴性预侧值100%.结论 HPV DNA分型检测对TCT结果为ASCUS患者有分流处理的作用.
