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miR-203通过靶向调控SOCS3影响人皮肤鳞癌细胞增殖、细胞周期行为及其机制研究
目的 探究miR-203对人皮肤鳞癌细胞A-431增殖、细胞周期行为的影响.方法 实时荧光定量PCR检测27对人皮肤鳞癌/癌旁组织及A-431/HaCaT细胞中miR-203的表达.在A-431细胞中过表达miR-203,针对miR-NC组和miR-203 mimic组,通过MTT、流式细胞技术检测miR-203对细胞增殖、细胞周期的影响.生物信息学对miR-203进行靶基因预测,并通过双荧光素酶实验确定miR-203和靶基因是否存在相互作用,Western Blot检测该靶基因在过表达miR-203皮肤鳞癌细胞中表达变化.结果 miR-203在皮肤鳞癌组织及癌细胞A-431中均显著低表达,相对癌旁组织及HaCaT细胞分别降低36％及40％.与miR-NC组比较,miR-203 mimic组抑制A-431细胞增殖,导致G1/S进程受阻,S期细胞减少.生物信息学分析表明SOCS3是miR-203直接作用的靶基因,双荧光素酶实验验证了该结果,且过表达miR-203可以明显下调SOCS3的蛋白表达量.结论 miR-203在人皮肤鳞癌中低表达,可以通过负调控靶基因SOCS3抑制鳞癌的生长,具有作为临床治疗靶标分子的潜能.
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肿瘤血管生成的靶向调控及其药物研究进展
肿瘤血管生成(Tumor Angiogenesis)对大多数实体瘤的生长和转移具有重要意义,是多步骤多因素参与复杂的病理过程.选择肿瘤血管生成中的一些关键环节或参与的重要因子作为靶点,研制应用特异性肿瘤血管生成抑制剂或抗体,以靶向调控肿瘤血管生成,控制肿瘤的生长和转移,达到治疗肿瘤的目的.本文对近年来肿瘤血管生成机制和肿瘤血管生成抑制剂的研究进展进行综述.
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雷帕霉素对RAW264.7细胞6种miRNAs表达的影响及miR-20a对ATG16L1的靶向调控作用
目的:探讨雷帕霉素对miR-17-92簇中的6种miRNAs表达的影响,及miR-20a对ATG16L1基因的靶向调控作用.方法:利用qRT-PCR检测雷帕霉素对RAW264.7细胞miR-17-92簇中的miR-20a等6种miRNAs的表达水平;通过双荧光素酶报告系统、Western blot,验证miR-20a对ATG16L1的靶向调控关系.结果:与正常组相比,雷帕霉素组RAW264.7细胞的miR-17、miR-18a、miR-20a表达水平显著上调(P＜0.05);3-MA组RAW264.7细胞的miR-20a表达水平显著下调(P＜0.05).双荧光素酶报告系统结果显示,miR-20a可靶向ATG16L1-3’-UTR,抑制其表达;Western blot结果显示,miR-20a能明显抑制ATG16L1蛋白的表达,说明miR-20a可靶向抑制ATG16L1的表达,参与调控细胞自噬过程.结论:miR-20可靶向抑制Atgl6L1的表达,参与调控RAW264.7细胞自噬过程.
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干细胞因子治疗——研究与展望
干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞,在一定的条件下,可分化为多种功能细胞.而干细胞因子是指可靶向调控干细胞的干性维持、定向分化等特性的重要因子,以及在干细胞治疗中产生的、对其修复损伤具有关键作用的活性因子.近年来,干细胞逐渐被应用到各种人类疾病的治疗中,但其临床应用仍然受到多种因素的制约.干细胞因子治疗为解决及避免这些问题带来了曙光,有望成为未来干细胞治疗的新方向.
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翻译起始的调控与肿瘤靶向基因治疗
真核细胞主要通过高度结构化的5'端非翻译区(5' untranslated region, 5'UTR)实现mRNA翻译起始的调控,其主要作用方式有3种,即通过本身高度复杂的二级结构在空间上阻碍翻译起始、通过其包含的上游AUG密码子(uAUG)和上游开放阅读框(uORF)元件来抑制翻译起始,以及通过其包含的内部核糖体进入位点(IRES)元件的"非帽依赖"(cap-indepen-dent)起始途径来抑制翻译起始.肿瘤细胞通常会过表达真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E)、 eIF4A、eIF4G等,这些因子可以通过解开5'UTR的复杂结构特异性地解除5'UTR的翻译抑制作用.目前应用5'UTR进行肿瘤靶向性基因治疗的思路是把肿瘤杀伤基因置于5'UTR调控之下,利用肿瘤细胞过表达翻译起始因子来发挥5'UTR在肿瘤细胞中的翻译竞争优势,实现治疗基因在肿瘤细胞中的特异性表达,从而达到靶向杀伤肿瘤的目的.
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miR-375靶向调控人矮小同源盒基因2基因在人食管鳞状细胞癌中的表达
目的 miR-375在食管鳞状细胞癌(简称鳞癌)中低表达,但其调控的下游靶基因仍不明确. 文中初步探讨miR-375在调控人食管鳞癌细胞中人矮小同源盒基因2(short stature homobox 2, SHOX2)的表达中的作用. 方法 运用生物信息学预测软件TargetScan、miRanda、PicTar、miRTarget2和PITA预测miR-375在SHOX2基因可能的作用位点. 构建野生型SHOX2 3′UTR报告基因载体(pSHOX2-375-WT)及突变型SHOX2 3′UTR报告基因载体(pSHOX2-375-mut),测序鉴定. 分7组转染:pmiR 组、pSHOX2-375-WT 组、pSHOX2-375-WT +miR-375 组、pSHOX2-375-WT +miR-NC 组、pSHOX2-375-mut 组、pSHOX2-375-mut+miR-375组、pSHOX2-375-mut+miR-NC组,分别检测荧光素酶活性. 转染miR-375的mimics于食管鳞癌细胞中,SHOX2 mRNA及蛋白表达分析. 另检测食管鳞癌组织术后标本miR-375及SHOX2表达. 结果 TargetScan、miRan-da、PicTar、MirTarget2和PITA软件预测结果显示miR-375 在SHOX2 3′UTR 1156-1170 bp区域有且仅有1个保守作用位点.pSHOX2-375-WT+miR-375组荧光素酶活性(0.261 ±0.036)显著低于[pmiR(1.818 ±0.061)、pSHOX2-375-WT组(1.820 ± 0.086)、pSHOX2-375-WT+miR-NC组(1.851 ±0.094)、pSHOX2-375-mut组(1.861 ±0.059)、pSHOX2-375-mut +miR-375 组(1.896 ±0.048)、pSHOX2-375-mut +miR-NC组(1.760 ±0.062)],差异均有统计学意义(P<0.01). 过表达 miR-375 后EC9706细胞SHOX2 mRNA及蛋白较对照组相比表达受到抑制. 食管鳞癌组织中的miR-375较癌旁组织表达降低,而SHOX2表达较癌旁组织表达增强. 结论 miR-375在食管鳞癌细胞EC9706中靶向调控SHOX2基因的表达.
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miRNA-129-5p靶向调控VCP基因在人骨肉瘤细胞中表达初步探讨
目的：含缬酪肽蛋白（valosin-containing protein， VCP）基因高表达能通过AKT/PI3K/NF-KappaB/MMP-9等信号通路促进骨肉瘤转移，但VCP基因上游调控机制仍不清楚。文中初步探讨miRNA-129-5p是否调控人骨肉瘤细胞中VCP基因表达及调控靶点。方法运用生物信息学预测软件TargetScanhuman 6．2（http：//www．targetscan．org/）预测miRNA-129-5p在VCP基因（ NM_007126）可能的作用位点。构建野生型VCP 3′UTR报告基因载体（ psi-VCP Vector ）及预测位点突变型VCP 3′UTR报告基因载体（psi-VCPmut Vector），测序鉴定。细胞转染分4组，psi-VCP Vector＋miRNA-129-5p mimic共转染U2-OS细胞为VCP实验组，psi-VCP Vector＋阴性miRNA mimic共转染U2-OS细胞为VCP对照组；psi-VCP突变Vector＋miRNA-129-5p mimic共转染U2-OS细胞为VCP突变实验组，psi-VCP突变Vector＋阴性miRNA mimic共转染U2-OS细胞为VCP突变对照组。分别检测荧光海肾素酶活性。结果 Targetscan软件预测结果显示miRNA-129-5p在VCP 3′UTR163-169 bp有且仅有1个保守作用位点；VCP 实验组荧光海肾素酶活性（15．529±1．902）低于VCP 对照组（21．781±0．854）、VCP 突变实验组（19．978±1．377）、VCP突变对照组（21．952±1．516），差异有统计学意义（P＜0．05）；VCP突变对照组（21．952±1．516）与VCP对照组（21．781±0．854），差异无统计学意义（P＝0．276）。结论 miRNA-129-5p在骨肉瘤细胞U2-OS中可能靶向调控VCP基因的表达及调控位点。
关键词： miRNA-129-5p 含缬酪肽蛋白 骨肉瘤 靶向调控 -
miRNA在胶质瘤组织和细胞中的表达及作用
miRNA是调节mRNA转录和翻译的一类非编码小RNA,可与特定的mRNA 3'UTR区完全或部分互补而调节蛋白质翻译过程,在细胞的增殖、凋亡、生长、分化和代谢等过程中有重要功能.miRNA在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用,部分miRNA有调节多种肿瘤相关基因及致癌功能,其表达失调可致下游肿瘤抑制基因、癌基因和其他信号分子活动改变.胶质瘤是常见的颅内原发性恶性肿瘤,研究miRNA在其组织和细胞中的表达及作用可为其诊治提供新的思路.
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微小RNA-204靶向抑制B淋巴细胞瘤-2影响非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡和迁移能力
目的 探讨微小RNA-204(miR-204)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其对A549细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响和对B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)的靶向作用机制.方法 以45例非小细胞肺癌组织、A549细胞株为研究对象,通过实时定量聚合酶链反应检测miR-204在NSCLC中的表达;转染miR-204模拟物和抑制剂,用细胞计数试剂盒(CCK-8)、Transwell、划痕实验、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3活性检测细胞增殖、迁移、凋亡能力变化;构建含有bcl-2 3'-非编码区野生型和突变型的双荧光素酶报告载体,并通过功能恢复实验,验证miR-204与bcl-2的靶向关系.结果 miR-204在非小细胞肺癌组织中的表达(1.28±0.31)较对照正常组织(3.75±0.27)明显降低(P=0.000),bcl-2在癌组织中表达明显增高(3.46 ±0.40比0.78±0.48,P=0.000),与TNM分期呈显著负相关,与年龄、性别关系差异无统计学意义;miR-204能明显抑制A549细胞的增殖、迁移,并促进细胞凋亡能力(P=0.000).共转染miR-204和bcl-2野生型3'非编码区双荧光素酶表达载体的A549细胞荧光活性为0.12±0.02,较对照组(0.29±0.03)显著下降(P=0.000),miR-204对细胞的增殖、凋亡、迁移能力的影响可以被过表达bcl-2所恢复.结论 miR-204在非小细胞肺癌中表达下调,可能通过靶向调控bcl-2的表达影响非小细胞肺癌的增殖、迁移、凋亡能力.
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细胞周期蛋白E小干扰RNA靶向调控乳腺癌移植瘤生长的研究
细胞周期蛋白(Cyclin)E是调控细胞从G1期进入S期的一个重要蛋白,它与乳腺恶性肿瘤的生长、增殖、内分泌治疗的敏感性以及病情预后都有密切联系.已有相关文章报道在体外Cyclin E能够高效地抑制乳腺癌细胞中Cyclin E的表达,从而抑制乳腺癌细胞的生长与增殖.我们通过建立不同模式的乳腺癌移植瘤模型来观察Cyclin E在体内对于成瘤能力的不同影响,展示针对Cyclin E的RNA干扰(RNAi)技术用于基因靶向治疗的潜在价值.
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膀胱癌中miR-128与血管内皮生长因子C的靶向调控关系
目的 研究人膀胱尿路上皮癌细胞和组织中的miR-128与血管内皮生长因子C(WGF-C)的靶向调控关系及其生物学功能.方法 收集9对配对的膀胱癌组织和其癌旁组织,1株人正常尿路上皮细胞(SV-HUC-1)和4株膀胱癌细胞(T24、5637、UM-UC-3和RT4),通过RT-PCR、Western Blot方法检测VEGF-C和miR-128的表达水平;将miR-128复合物或miR-128抑制剂等复合物转染到2株膀胱癌T24和5637细胞中,检测miR-128对其生长、迁移及侵袭的影响;生物信息学软件预测分析miR-128的靶基因,双荧光素酶实验验证miR-128是否靶向作用VEGF-C.结果 相比癌旁组织和正常尿路上皮细胞,膀胱癌组织和细胞中miR-128的表达明显下调(P＜0.05),而VEGF-C在癌组织和细胞中都呈现高表达(P＜0.05).miR-128可抑制膀胱癌细胞生长、克隆形成及迁移侵袭(P＜0.05).双萤光素酶报告实验证实miR-128靶向作用VEGF-C(P ＜0.05).结论 miR-128在膀胱癌中表达下调,而VEGF-C表达上调;miR-128可通过靶向调控VEGF-C影响膀胱癌细胞的增殖和转移.
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MiRNA376a/c靶向调控TGFA对CD133+U251胶质瘤细胞增殖的影响
目的:探讨微小核糖核酸(MicroRNA,MiRNA)376a/c靶向调控转化生长因子α(transforming growth factor alpha,TGFA)在CD133+U25l胶质瘤细胞增殖中作用方式及其机制.方法:构建MiR376a/c靶向调控TGFA慢病毒克隆体,根据MiR376a/c与TGFA结合位点分为4组,检测各组酶活性.根据转染体外MiR376a/c和MiR376a/c模拟物(MiR-SCR)不同,将CD133+U251细胞分为4组,通过细胞培养、Gimsa染色,检测TGFA蛋白表达量和细胞生长曲线,观察细胞增殖情况,收集资料并进行统计学分析.结果:CD133+组与CD133-组MiR376a/c表达比较,差异有统计学意义(P＜0.001);wt-TGFA组与mut-TGFA组质粒荧光素酶活性表达差异比较,差异有统计学意义(P=0.000);将MiR376a/c慢病毒导入CD133+ U251细胞中,MiR376a/c组TGFA蛋白表达相对于MiR-SCR组和空白对照组明显下调,差异有统计学意义(P=0.000);生长曲线检测示:随时间延长,MiR376a/c组细胞生长速度慢于对照组,差异有统计学意义(P=0.000).结论:MiRNA376a/c靶向调控TGFA抑制CD133+U251胶质瘤细胞增殖、克隆.
关键词： MiRNA376a/c CD133+U251 增殖 靶向调控 -
靶向调控FASN的miRNAs在不同侵袭力骨肉瘤细胞中的表达
目的：检测可能调控脂肪酸合成酶（FASN）基因表达的miRNAs分子在不同侵袭力骨肉瘤细胞中的表达，筛选出靶向调控FASN基因的miRNAs分子，为研究骨肉瘤转移调控机制奠定基础。方法应用miRNA和microrna．org在线软件，预测可能靶向调控FASN基因（NM＿004104）表达的miRNAs分子；实时定量PCR（RT‐PCR）检测所预测到的miRNAs在骨肉瘤细胞HOS和U2‐OS中的表达；Westernblot检测HOS和U2‐OS细胞中FASN蛋白表达；Transwell侵袭实验检测HOS和U2‐OS细胞侵袭力。结果2种生物信息学预测方法预测结果均显示，FASN基因可能是miR‐195／15a／15b／16／424／497分子的靶基因；RT‐PCR结果显示，miR‐424在HOS细胞中表达水平显著高于在U2‐OS细胞中的表达水平；FASN在U2‐OS细胞中表达水平显著高于HOS细胞中的表达水平；U2‐OS细胞侵袭能力明显高于HOS细胞的侵袭力。结论miR‐424在骨肉瘤细胞中表达水平与细胞侵袭力呈负相关，miR‐424很可能通过靶向调控FASN基因影响骨肉瘤细胞侵袭转移。
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miR-144通过靶向Atg4a调控卡介苗和雷帕霉素诱导的RAW264.7细胞自噬
目的 研究卡介苗(BCG)对RAW264.7细胞中与细胞自噬相关的miRNA(miR-21、miR-181a、miR-155和miR-144)表达的影响,并以miR-144为研究对象,验证miR-144对自噬相关基因Atg4a的靶向调控关系,探究其在结核分枝杆菌感染宿主细胞过程中调控细胞自噬途径的作用机制.方法 分别对RAW264.7巨噬细胞进行饥饿处理12 h、50 ng/mL雷帕霉素作用2h、10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h;BCG刺激RAW264.7巨噬细胞12 h、24h、48 h后,收集细胞,提取总RNA;利用实时定量PCR (qRT-PCR)检测miR-21、miR-181a、miR-155及miR-144的表达水平;构建pMIR-Report-Atg4a及pMIR-Report-Atg4a mut重组质粒,利用双萤光素酶报告系统、qRT-PCR及Western blot法验证miR-144与Atg4a的靶向作用关系.结果 BCG刺激RAW264.7巨噬细胞后,可使miR-21、miR-155及miR-144表达上调,miR-181a表达下调;经雷帕霉素诱导的细胞自噬,4种miRNA表达量与正常组相比分别上调约64倍、52倍、14倍、1倍;与正常组相比,3-MA处理细胞组,miR-21、miR-144、miR-155、miR-181a的表达量分别下调1.22倍、1.05倍、1.54倍及12.5倍;双萤光素酶报告系统及Western blot法证实,miR-144可靶向作用于Atg4a-3' UTR并抑制其表达.结论 miR-144可靶向抑制自噬相关基因Atg4a的表达,参与调控RAW264.7巨噬细胞的自噬过程.
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pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究
目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系.方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Westem blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系.结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒.Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达.结论:所制备的小鼠pri- miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达.
关键词： pri-m1R-21 重组腺病毒载体 TLR4基因 靶向调控 -
苏子油干预血管内皮细胞miR-21靶向调控MMP-9的机制
目的 探讨不同浓度苏子油干预人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC) miR-21和基质金属蛋白酶MMP-9的表达,为苏子油改善动脉粥样硬化提供依据.方法 体外培养HUVEC,以TNF-α诱导细胞进行造模,将细胞分为空白组、模型组及苏子油高、中、低剂量组.MMT法检测各组细胞A值;PT-PCR检测细胞miR-21、MMP-9基因水平;脂质体转染法将miR-21模拟物转入HUVEC细胞,Western blot检测转染后MMP-9蛋白的表达.结果 苏子油高、中、低剂量能明显改善TNF-α诱导的HUVEC损伤,且苏子油对内皮细胞的保护作用呈剂量依赖关系;RT-PCR结果显示,模型组miR-21及MMP-9的表达高,苏子油干预后,miR-21及MMP-9基因的表达逐渐减弱,且二者分别与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞转染miR-21后,MMP-9蛋白的表达显著增强;miR-21与MMP-9 mRNA3'UTR区经生物信息学软件预测存在靶向结合位点.结论 苏子油可能通过干预miR-21靶向调控MMP-9的表达对血管内皮细胞发挥保护作用,从而发挥抗动脉粥样硬化作用.
