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肝螺杆菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用研究
目的 建立特异、敏感、快速检测肝螺杆菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法.方法 针对肝螺杆菌flaB 基因的保守区设计特异性引物和探针,建立肝螺杆菌TaqMan MGB探针实时荧光定PCR方检测方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年期间采集的1081份临床样本中的肝螺杆菌进行检测,同时进行分离培养和常规PCR检测.结果 建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对肝螺杆菌的检测具有高度的特异性,对幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均无交叉反应,检测的灵敏度达8.3拷贝.标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.227,TaqManMGB探针实时荧光定量PCR效率为100％.对1081份临床样本进行检测,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR和常规PCR均能检出86份肝螺杆菌阳性样本,而细菌分离培养则仅检出4份阳性.结果显示,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比细菌分离培养方法更敏感,能够直接从临床样本中检出肝螺杆菌DNA,检测时间仅为2h.结论 研究建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于肝螺杆菌的快速检测.
关键词： 肝螺杆菌 小沟结合物(MGB)探针 实时荧光定量PCR 检测 -
肝螺杆菌感染与原发性肝癌的相关性研究
原发性肝癌(PLC)是一种严重危害我国人民健康的疾病.有国外学者利用聚合酶链反应(PCR)、DNA序列分析、电镜、免疫组化及细菌培养技术证实了肝癌组织中确实存在螺杆菌感染.针对目前研究现状,我们采集了PLC患者新鲜的癌组织,分别做了细菌培养和扫描电镜的金标准检测,阳性者扩增肝螺杆菌(Hp)的重要相关基因vacA、cagA,DNA序列测定作为确认试验.从细胞水平、分子水平确认螺杆菌与PLC相关性.
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啮齿动物螺杆菌多重PCR检测方法的建立
目的 建立一种可同时检测肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌的多重PCR方法.方法 根据已公布的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌16SrRNA基因序列设计三对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化.结果 三对引物能分别扩增出特异性的417 bp、364 bp、324 bp目的 条带.佳退火温度为52℃,镁离子浓度为2.0 mmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,引物浓度为0.625 μmol/L.在此条件下多重PCR同时检测的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌敏感度均为10 fg.结论 本实验建立的多重PCR是一种敏感、特异、高效的方法,为同时检测啮齿动物中肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌奠定了良好的基础.
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肝螺杆菌及相关疾病的研究进展
自幽门螺杆菌被发现以来，越来越多的肠螺杆菌被人们从动物或人的消化道中分离，迄今为止已发现并命名肠螺杆菌20余种，其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、胆汁螺杆菌（H ．bilis）、胆囊螺杆菌（H ． cholecystus）、犬螺杆菌（H ． canis）、幼禽螺杆菌（H ．pullorun）以及肝螺杆菌（H ．hepaticus）6种被证明与人和动物的胃肠肝胆疾病有关［1］。1992年，美国国家癌症研究所Frederick癌症研究和发展中心发现无菌饲养 A／JC r小鼠出现不明原因肝炎和肝脏肿瘤［1］。1994年，Fox等先报道在A／JCr小鼠肝炎组织中分离出一种新的非胃内且耐胆汁的螺杆菌［2］，后被命名为肝螺杆菌。此后对于肝螺杆菌的研究逐渐成为热点，众多国内外实验室展开对于肝螺杆菌形态、生化反应、基因测序、分离鉴定等多项研究，并取得较大进展，对于在国内开展有关肝螺杆菌的研究具有重要意义。
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肝螺杆菌与肝癌
1 肝螺杆菌与肝病的研究1994年Ward-JM等正式报道了一种新型嗜肝螺杆菌,发现其与动物肝炎的发展有关,定名为肝螺杆菌(Helicobactel Hepaticus,HH).进一步研究发现HH是一种微需氧菌,普通培养和厌氧培养难以成功,继之国内外对该菌的形态学、理性特征、核甘酸序列、培养分离方法及病原学地位进行了系列研究.这种细菌在患肝炎动物的肝组织和肠粘膜中分离成功.
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肝螺杆菌感染与肝脏疾病
自1982年发现H.Pylori以来,迄今已发现至少20余种正式命名的螺杆菌,肝螺杆菌[1](helicobacter hepaticus,Hh)是被证实对某些动物肝脏有致病性的细菌,它可以引起某些品系的小鼠发生慢性活动性肝炎,并能导致敏感小鼠的肝癌.本文就Hh与肝脏疾病相关性的研究概况作一介绍.
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慢性肝病患者肝螺杆菌血清抗体水平分析
目的 分析不同病因慢性肝病患者血清肝螺杆菌抗体(抗H.hepaticus-IgG)相对抗体活性(RAA)以及螺杆菌抗原之间的交叉反应.方法 随机选取不同病因的慢性肝病患者(CLD) 76例(其中慢性乙型病毒性肝病27例、慢性丙型病毒性肝病25例、自身免疫性肝炎8例和慢性酒精性肝病16例)、健康献血者80名以及体检人群80名,应用ELISA方法检测吸收试验前后血清中抗H.hepaticus-IgG相对抗体活性.结果 CLD患者抗H.hepaticus-IgG抗体的RAA明显高于献血者和普通人群组(P ＜0.001)；CLD患者和普通体检人群抗H.pylori-IgG抗体的RAA平均值明显高于献血者(P ＜0.001)；CLD患者中除自身免疫性肝炎患者外,慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus-IgG抗体的相对抗体活性反应均明显增高,慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus-IgG抗体的RAA值明显高于其他肝病患者(P＜0.001),吸收试验前后抗H.hepaticus-IgG抗体的RAA值无显著性变化(P＞0.05).结论 H.hepaticus和H.pylori的细胞表面蛋白具有较高的交叉反应,慢性肝病患者抗H.hepaticus-IgG抗体反应在吸收试验后仍保持较高水平.
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肝螺杆菌研究进展
肝螺杆菌是一种新型肠肝螺杆菌.感染肝螺杆菌可引起免疫功能健全的多种品系小鼠慢性活动性肝炎以及免疫功能缺陷某些鼠系的炎症性肠病,且与A/JCr鼠肝癌的发生有高度的相关性.目前已在小鼠体内复制出动物慢性肝炎和肝癌模型.近年人类肝螺杆菌的相关研究也已起步.本文就肝螺杆菌的生物学、分子生物学特性及相关性疾病的研究进展进行综述.
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肝螺杆菌感染可能与炎症性肠病有关
肝螺杆菌(helicobacter hepaticus,Hh)是近年来发现的螺杆菌属中又一新菌种.已有的研究表明,Hh除了与慢性活动性肝炎和肝癌关系密切外,与炎症性肠病(IBD)的发生也有关.现就其与IBD的关系研究近况综述如下.
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肝螺杆菌鞭毛蛋白B基因的克隆和序列测定
目的 对肝螺杆菌BJ 0801鞭毛蛋白B(flagellin B,fla B)基因进行扩增、克隆和序列测定,以探讨其功能.方法 根据已公布的肝螺杆菌ATCC 51449序列,设计合成一对引物,以肝螺杆菌BJ 0801株DNA为模板,扩增fla B基因片段,与pGEM-T载体连接并转化感受态E.coliDH5α,提取的重组质粒经双酶切、PCR、电泳鉴定并进行序列测定.结果 目的 基因片段长度为1 545 bp,与已公布的肝螺杆菌ATCC 51449核苷酸同源性达99%.结论 成功克隆出肝螺杆菌BJ 0801鞭毛蛋白B基因序列,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
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肝螺杆菌致肝癌的细胞和分子机制
肝螺杆菌与小鼠慢性肝炎有关,可使之发展成肝癌,目前已在小鼠体内成功复制出动物慢性肝炎和肝癌模型.近年研究发现,宿主因素、慢性感染过程中的氧化损害、癌基因激活、细胞周期蛋白(Cyclin)表达异常是肝螺杆菌肝炎发展成肝癌的可能原因.
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肝螺杆菌与相关性疾病的研究进展
近年,从小鼠中分离的肝螺杆菌被明确证实有致病力,能导致多种品系小鼠的慢性肝炎,且与A/J Cr鼠肝癌的发生有高度的相关性.本文对肝螺杆菌的微生物学、分子生物学特性以及相关性疾病的研究进展作了综述.
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首次从中国小鼠中分离到肝螺杆菌及其鉴定
目的 对中国小鼠肝螺杆菌进行分离鉴定.方法 采集中国某实验动物中心发病小鼠标本,采用细菌学分离培养、血清学试验、多重PCR检测、病理组织学检查等方法进行鉴定,并对细菌的分子生物学特征进行分析.结果 分离到一株能产生多种毒素的细菌,经鉴定为肝螺杆菌(HHm0801).用螺杆菌属16S rRNA基因特异引物和肝螺杆菌16S rRNA基因、fla A基因、fla B基因、ure A基因、cdt B基因、cdt C基因特异引物对HHm0801细菌的PCR扩增为阳性,经核苷酸序列测定分析证实上述序列与肝螺杆菌ATCC 51449基因序列(GenBank登录号:NC 004917)同源性高达99 %.肝螺杆菌感染小鼠肝脏的肝细胞肿大,出现大小不等的空泡,部分胞核深染,局部坏死,肝小叶脂肪变性;直肠部分绒毛脱落,有少量炎性细胞,局部充血.脾脏淋巴细胞散在分布,小叶间隔不清晰,脾巨噬细胞增多.眼睛巩膜增厚,晶状体部可见深色物质沉着.结论 首次从中国小鼠中分离到了肝螺杆菌,为进一步研究该菌及开展流行病学调查提供了科学依据.
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肝螺杆菌多重PCR检测方法的建立及应用
目的 建立肝螺杆菌的多重PCR检测方法,对中国动物肝螺杆菌进行检测.方法 以毒力基因fla B基因、ure A基因和cdt B基因和cdt C基因作为靶基因,建立检测肝螺杆菌的多重PCR方法.对肝螺杆菌、空肠弯曲菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞杆菌抽提的DNA进行多重PCR扩增.应用本研究建立的多重PCR检测方法对482只动物(其中:海南30只猴、江苏34只小鼠和北京32只猴、30头猪、66只犬、13只兔、29只豚鼠、69只大鼠、213只小鼠)进行检测,对扩增出的阳性结果进行测序.同时,对所有样本采用选择性培养基进行肝螺杆菌培养以作对照.结果 肝螺杆菌能扩增出各自的特异性条带,而其他参考菌株均未扩增出条带,这表明该方法具有较强的特异性.482份样本中检出43份肝螺杆菌阳性样本,阳性率8.92 % (43 / 482),其中:2只犬(3.03 %,2 / 66)、1只兔(7.69 %,1 / 13)、5只大鼠(7.25 %,5 / 69)和35只小鼠(16.43 %,35 / 247)均扩增出肝螺杆菌毒力基因片段.结果 显示,肝螺杆菌fla B基因、ure A基因和cdt B基因和cdt C基因序列与GenBank中的肝螺杆菌ATCC 51449的相应基因序列核苷酸同源性高达99 %.用选择性培养基能培养出肝螺杆菌.结论 中国动物中的犬、兔、大鼠和小鼠均能检出肝螺杆菌fla B基因、ure A基因、cdt B基因和cdt C基因.建立的多重PCR检测方法可作为肝螺杆菌大规模检测的新技术,这为在中国开展肝螺杆菌流行病学调查提供了有效科学工具.
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肝螺杆菌致病机制的研究进展
肝螺杆菌是一种人兽共患病病原,可引发多系统疾病.其致病性与毒力因子有关,细胞致死性肿胀毒素会阻断细胞在G2/M期生长,引起细胞凋亡,同时还能激活NF-κB通路,释放细胞因子,引发炎症;鞭毛蛋白、粘附素、铁蛋白DPS、抗氧化酶、尿素酶等,利于肝螺杆菌定植、生长和发挥致病作用;毒力基因包含一个Ⅵ型分泌系统(T6SS),可将毒力相关基因编码的毒力蛋白释放到机体中,引起机体免疫反应.本文阐述了肝螺杆菌毒力因子对机体损伤的作用机制,旨在为深入了解肝螺杆菌致病机制提供参考.
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肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达及纯化
目的 克降肝螺杆菌(H.hepaticus)甲基基团接受趋化信号转导蛋白(MCP)甚因,制备MCP重组蛋白,为以后检测我国人群肝螺杆菌感染率提供实验基础方法利用PCR方法扩增目的 基因片段,连接至原核表达载体pET22b(+),构建MCP的原核表达质粒pET22b+/MCP将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组蛋白.结果 构建了原核表达质粒pET22b+/MCP,含有该质粒的大肠杆菌经1 mmol/L IPTG诱导4 h后表达一相对分子质量约14 kD的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析系统纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP.结论 获得了肝螺杆菌MCP的纯化重组蛋白,为进一步利用血清学方法调查我国人群肝螺杆菌感染率提供可能.
关键词： 肝螺杆菌 甲基基团接受趋化信号转导蛋白 克隆 重组蛋白 -
肝螺杆菌脂多糖提取及纯化方法的建立
目的 建立肝螺杆菌脂多糖(LPS)提取与纯化方法.方法 采用脂多糖提取试剂盒提取肝螺杆菌LPS,并用DNase I和RNase酶除去DNA和RNA,纯化LPS.三次测定LPS中糖、蛋白质及核酸的含量,并用SDS-PAGE电泳银染方法分析LPS纯度.结果 肝螺杆菌为形态细小、Giemsa's染色阴性的不规则螺旋型杆菌.纯化的LPS平均产率为0.202％,平均蛋白质含量为0.365 g/L,平均核酸含量为0.413 mg/L,三者结果的稳定性好,批间比较差异无统计学意义(P＞0.05).SDS-PAGE电泳结果显示,LPS提取物与标准品比较,主要条带清晰,位置相同.结论 建立了一种有效提取肝螺杆菌LPS的方法,该方法简便可行、提取物纯度高,核酸及蛋白质含量低,值得推广应用.
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肝螺杆菌与幽门螺杆菌的功能基因组比较分析
肝螺杆菌(Hh)是迄今为止发现与肝脏疾病相关的5种螺杆菌之一.Hh株ATCC51449的全基因组测序已经完成.研究发现Hh有和幽门螺杆菌(Hp)一样的尿素酶、鞭毛蛋白和黏附素同源基因,而编码趋化蛋白及细胞致死性肿胀毒素(CDT)的特性则与空肠弯曲菌类似.Hh缺乏大多数与Hp同源的定植和毒力因子如cag致病岛.此外Hh还有一个与霍乱弧菌相似的致病岛HHGI1.上述基因特点导致该菌肠道定植的适应性与致病潜能.
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肝螺杆菌感染与人类原发性肝细胞癌的相关性研究
目的 本研究旨在了解肝肠源性螺杆菌是否存在于肝细胞癌患者的胆汁内,探讨此菌与肝癌的相关性.方法 收集经病理确诊的47 例原发性肝细胞癌患者及24 例结肠直肠癌肝转移患者的胆汁标本.使用特定16S rRNA 引物的聚合酶链式反应(PCR)及DNA 测序检测胆汁标本中的螺杆菌属及肝螺杆菌特异性16S rRNA,并使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测胆汁标本中的肝螺杆菌抗体.结果 47 例原发性肝细胞癌患者胆汁标本中有12 例(25.5%)检测出肝螺杆菌特异性16S rRNA,15 例(31.9%)检测出抗肝螺杆菌抗体;24 例结肠直肠癌肝转移患者胆汁标本中只有1 例(4.2%)检测出肝螺杆菌特异性16SrRNA 基因,3 例(12.5%)检测出抗肝螺杆菌抗体(P < 0.05).结论 原发性肝细胞癌患者可检测出肝螺杆菌,这可能与肝细胞癌的发病机制有一定联系.
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肝螺杆菌MCSTP的基因克隆及生物信息学分析
目的 克隆肝螺杆菌(H.hepatieus)基基团接受趋化信号转导蛋白(MCSTP)全基因,并应用生物信息学方法对其进行分析.方法 以肝螺杆菌全基因组作为模板,设计肝螺杆菌MCSTP c1977特异性引物,利用PCR方法扩增目的 基因片段,连接至原核表达载体pET22b(+).从而构建原核表达质料pET22b+/MCSTP并测序鉴定.廊用牛物信息学方法分析MCSTP基囚的序列同源性及其结构特征.结果 克隆的MCSTP基因经测序可知与GenBank公布的肝螺杆菌标准株ATCC51449序列一致性达99%,仅第1 160 bp处由A变为T.利用生物信息学方法进行分析可发现此基因与空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌具有非常低的相似性,表明其在微生物界巾具有一定的特异性.结论 成功构建pET22b+/MCSTP重组质粒,并通过生物信息学技术进行序列及结构分析,为进一步研究其生物学功能及致病机制提供了线索和依据.
