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蠕虫NADH-延胡索酸还原酶模型优化及沃特曼内酯F 的活性评价
目的 优化蠕虫 NADH-延胡索酸还原酶及哺乳动物NADH 氧化酶的高通量筛选模型,评价沃特曼内酯 F 的活性及选择性.方法 提取猪蛔虫和猪心线粒体,对温度、pH、NADH 浓度和线粒体浓度等参数进行优化,确定适宜反应条件.在佳反应条件下测定沃特曼内酯 F 对猪蛔虫 NADH-延胡索酸还原酶和猪心 NADH 氧化酶的抑制活性.结果 猪蛔虫 NADH-延胡索酸还原酶佳反应条件为37 ℃,pH 6.5,NADH 浓度为 0.18 mmol/L,线粒体浓度为0.025 g/L.沃特曼内酯 F 的 IC50 为 5.0 nmol/L;对于猪心NADH 氧化酶的 IC50 大于 6.2 μmol/L.结论 沃特曼内酯 F 是一种选择性猪蛔虫 NADH-延胡索酸还原酶的抑制剂,抑制活性达到了 nmol/L 级,具有成为新型抗蠕虫药物的潜力.
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NAD(P)H:醌氧化还原酶基因多态性与阿尔茨海默病遗传易感性的关系
目的探讨NAD（P）H：醌氧化还原酶（NQO1）基因C609T位点基因多态性与散发性阿尔茨海默病（SAD）遗传易感性的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了120例SAD患者和122名健康老年人的NQO1基因多态性分布特征。结果 SAD组C等位基因频率低于对照组,SAD组为45.0%，对照组为57.0%（OR=0.63,P＜0.05）。SAD组C/C基因型频率明显低于对照组，SAD组为12.5%，对照组为29.5%（OR=0.34，P＜0.01）。结论 NQO1基因多态性与SAD发病明显关联，NQO1基因609序列C/C基因型、C等位基因与SAD发病呈明显负关联。NQO1基因609序列C等位基因对SAD发病可能有保护作用。
关键词： 阿尔茨海默病 遗传学 NADH NADPH氧化还原酶类 -
卵巢上皮性癌组织中GRIM-19蛋白的表达及其临床意义
目的 探讨细胞凋亡相关基因19(GRIM-19)蛋白在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中的表达及其与卵巢癌患者临床病理指标和预后的关系.方法 收集2000年1月-2006年12月在浙江大学医学院附属妇产科医院手术切除的138份卵巢癌、101份卵巢良性上皮性肿瘤和46份正常卵巢组织标本,采用免疫组化法检测其GRIM-19蛋白的表达水平.并采用Mann-Whiteny U和Kruskal-Wallis H检验进行非参数分析,比较不同临床病理指标的卵巢癌组织中GRIM-19蛋白的表达水平；采用Kaplan-Meier和log-rank检验进行单因素生存分析,比较不同GRIM-19蛋白表达水平(分为阴性、弱阳性、中等阳性、强阳性组)的卵巢癌患者的预后；采用多因素Cox回归模型,分析影响卵巢癌患者预后的因素.结果 免疫组化法检测显示,卵巢癌、卵巢良性上皮性肿瘤、正常卵巢组织中GRIM-19蛋白的表达水平分别为(3.4±2.0)、(4.7±2.9)和(7.5±2.2)分,两两比较,差异均有统计学意义(P ＜0.01)；3 者间比较,差异也有统计学意义(P＜0.01).非参数分析显示,GRIM-19蛋白的表达水平与卵巢癌患者的腹水量明显相关(P =0.043),而与卵巢癌患者的年龄、血清CA125水平、病理分化程度、病理类型、手术病理分期、淋巴结转移、原发肿瘤大直径、术后残留灶直径无关(P＞0.05).GRIM-19蛋白表达阴性、弱阳性、中等阳性、强阳性组卵巢癌患者分别为38、77、21、2例,单因素生存分析显示,4组间总生存时间比较,差异有统计学意义(P =0.002)；4组间无瘤生存时间比较,差异也有统计学意义(P=0.008).多因素Cox回归模型分析显示,GRIM-19蛋白表达水平(P=0.001)、手术病理分期(P =0.001)、腹水量(P=0.023)和原发肿瘤大直径(P =0.044)是影响卵巢癌患者预后的独立因素.结论 GRIM-19蛋白在卵巢癌组织中的表达明显下降,提示GRIM-19可能是一种新的抑癌基因；GRIM-19蛋白的表达水平是影响卵巢癌患者预后的独立因素,提示其对卵巢癌患者的预后可能有预测价值.
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不同强度运动时大鼠骨骼肌能量代谢产物的变化
本研究旨在观察不同强度运动时,与能量代谢有关的骨骼肌腺嘌呤核苷酸(ATP)、磷酸肌酸(CP)、乳酸(LA)和呼吸链氧化还原的变化特点,以进一步阐明训练中运动强度这一重要因素的生理意义.雄性SD大鼠先经5周耐力训练筛选,再进行3周递增速度训练.正式实验时,随机分成6个强度组(0 m/min、18 m/min、30 m/min、42 m/min、54 m/min、66 m/min),6只/组,每组以6 m/min的增幅进行3分钟准备活动(0 m/min组为安静时处死),然后以预定强度跑3分钟后立即处死,取右腿用液氮固定,凿取腓肠肌,经冷冻干燥后制备肌肉提取液.用高效液相法测定肌肉ATP、ADP、AMP、CP、NADH和NAD+,用紫外分光法检测肌乳酸.结果表明,随着运动强度的增加,运动后即刻大鼠腓肠肌能量代谢产物的变化如下:(1)ATP浓度在18～42 m/min范围内呈下降趋势,超过42 m/min出现上升趋势,其中,42 m/min组比安静组降低(P < 0.01),54 m/min组较42 m/min组升高(P < 0.05);ADP和AMP的变化表现为波动性上升的趋势;CP浓度、能荷(EC)以及ATP/ADP的比值呈波动性下降趋势;同时,随着ATP/ADP比值的下降,AMP的生成增加,CP逐渐降解.(2)肌乳酸、NADH和NADH/NAD+比值呈波动性上升趋势,当强度大于42 m/min时NADH/NAD+明显上升,而NAD+则是上下波动,其中,54m/min组的乳酸,NADH和NADH/NAD+比42 m/min和0 m/min组显著升高(P < 0.01).(3)随ATP/ADP比值下降,NADH/NAD+比值增加,肌乳酸生成增加;肌乳酸含量随NADH/NAD+比值的升高而升高.结论:ATP、NADH、NADH/NAD+比值、肌乳酸都在42 m/min强度出现大幅度增加,提示:在30～42 m/min强度存在一个转折点,乳酸阈可能在此范围内.NADH含量和NADH/NAD+比值变化对乳酸阈的形成是重要的调节因素,而这种调节作用的根源在于机体能量状态(ATP/ADP)的变化.
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高效液相色谱法测定骨骼肌ATP、ADP、AMP、NAD+、NADH含量
采用高效液相色谱法测定骨骼肌腺嘌呤核苷酸和辅酶Ⅰ含量.高压液相系统包括:惠普公司ZOBAX -C18反相柱(5mm×12cm),590UV检测器.流动相为220mmol/L磷酸钾缓冲液,内含10%甲醇,用四丁基氢氧化胺(TBAH)调pH至6.5.等比洗脱,流速为0.8ml/min.检测波长为254nm.所有样品和标准品在进样前均用0.45μm孔径的虑膜过滤后进样5μl作色谱分析.结果表明:HPLC可以同时测定ATP、ADP、AMP、NAD+、NADH,分离效率高,操作简便,快速(每个样品仅需15分钟),而且,重现性好,定性可靠,定量准确.
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NADH对X射线诱导的细胞凋亡信号传递的影响
目的 研究NADH抗辐射诱导的细胞凋亡及其作用机制.方法 通过MTT法和流式细胞仪检测L02细胞受照后加和不加NADH(400μg@ml-1)条件下细胞活性、细胞凋亡率和凋亡相关蛋白p53、p21、p16、bcl-2阳性细胞表达率.结果 细胞活性随X射线辐射剂量增大而减少,细胞凋亡率增加,NADH能增加肝细胞受照后细胞活性和减少细胞凋亡率.与假照射组相比,L-02细胞离子辐射后p53、p21和p16阳性表达率上升,bcl-2下降;加入NADH后,明显上调受照后肝细胞bcl 2蛋白表达和下调p53、p21和p16表达,差异非常显著(P<0.05).结论 X射线诱导正常肝细胞L-02凋亡及NADH抗辐射作用可能与p53信号传递途径有关.
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50Hz正弦磁场对肌质网钙释放通道Ryanodine受体的影响
目的 探讨正弦磁场对提取的骨骼肌肌质网(SR)囊泡钙释放通道(RyR1)的影响.方法 采用动态光谱法和同位素标记方法 ,分别检测了正弦磁场对SR囊泡Ca2+释放初速率、[3H]-Ryanodine平衡结合度、还原型辅酶(NADH)的氧化初速率和超氧(O·2-)产率的影响.结果 0.4 mT、50 Hz正弦磁场辐照SR囊泡30 min,由1 mmol/L NADH与1 mmol/L NAD调控的Ca2+释放初速率Con组为(10.82±0.89)pmol·mg-1 pro·s-1、MF组为(14.69±1.21)pmol·mg-1pro·s-1;上调了35%,[3H]-Ryan-odine平衡结合度上调15%,由(2.13±0.05)pmol/mg pro上升到(2.45±0.07)pmol/mg pro.另外,该磁场辐照SR囊泡30 min,导致NADH的氧化速率上调22%,由(0.88±0.11)×10-4FI/s上升到(1.07±0.13)×10-4FI/s;O·2-产率上调32%,由(0.99±0.09)×10-5FI/s上升到(1.31±0.06)×10-5FI/s. 结论 0.4 mT正弦磁场在低氧化还原电势环境下对RyR1有显著的激活,且该磁场促进了NADH氧化酶的活力和O·2-产率的增加.
关键词： 电磁场 兰尼碱受体钙释放通道 NADH NADPH氧化还原酶类 -
国产吲哚青绿前囊膜染色对免角膜内皮活性的影响
[目的]研究不同浓度与不同时间条件下国产吲哚青绿晶状体前囊膜染色对兔角膜内皮活性的影响.[方法]选择健康科研兔18只(36眼),随机分为4组,即A、B、C 3组分别为2.5 mg/mL、5 mg/mL、7.5 mg/mL的国产吲哚青绿溶液组,D组为平衡盐液(BSS)做对照,每组9眼,每组分3亚组分别给予上述溶液作用30、60、90 s,以酶组织化学染色方法测定不同处理的活体兔角膜内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)与还原型辅酶I(NADH)的活性改变.[结果]LDH、NADH活性在A组、B组与D组比较差异均无显著性意义(P>0.05),而C组在30、60、90 s LDH光密度值分别为(186.12±12.12)A、(169.97±11.14)A、(161.82±17.91)A,NADH光密度值分别为(178.86±12.67)A、(165.39±18.79)A、(158.81±17.48)A,LDH、NADH活性在C组与A组、B组、D组比较差异均有显著性意义(P<0.05).C组组内,酶的活性与药物接触角膜时间呈线性关系,负相关.r=0.45,P<0.05.[结论]2.5 mg/mL与5 mg/mL国产吲哚青绿溶液晶状体前囊膜染色在90 s以内均安全、可靠,对兔角膜内皮细胞活性无影响.而7.5 mg/mL国产吲哚青绿溶液行前囊膜染色在3个时间段对兔角膜内皮活性均产生不同程度影响,酶活性与时间呈负相关.
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酿酒酵母甲酸脱氢酶在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其酶学性质
目的 克隆酿酒酵母甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH)基因,在大肠杆菌中表达、纯化重组蛋白,并进行酶学性质分析.方法 以酿酒酵母基因组DNA为模板,采用温度梯度PCR法扩增fdh基因,重叠PCR技术校正fdh中的移码突变,构建重组表达质粒pET-28a-fdh,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,分别采用37℃IPTG诱导、15℃IPTG诱导和37℃乳糖自诱导表达,镍金属螯合亲和层析纯化重组FDH蛋白,并分析重组FDH的酶学性质.结果 成功克隆了1 100 bp的fdb基因,碱基突变纠正了基因缺失和置换引起的编码错误;表达的重组FDH相对分子质量约为43 000,37℃乳糖诱导表达的重组FDH主要以可溶形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋门比活为7.69 U/mg;重组FDH的适反应温度和pH分别为30℃和7.5,热稳定性较好,米氏常数分别为:KmNAD+=49μmol/L,Km甲酸=4.5 mmol/L.结论 已在大肠杆菌中表达并纯化了重组FDH蛋白,为进一步研究酿酒酵母FDH,利用其构建NAD(P)H辅酶再生体系奠定了基础.
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NADH对X射线照射正常肝细胞L02后PARP和Caspase 3活性的影响
目的：为了研究NADH对X射线诱导的细胞凋亡和PARP、Caspase 3活性的影响。方法设假照射组、对照组及处理组。处理组正常肝细胞在6MV Varian 5．0Gy照射后立即加入含NADH（400μg／mL） RPMI 1640完全培养基，假照射组和对照组只加入培养液，培养24 h，用Annexin V／PI法检测细胞凋亡率；流式细胞仪检测bcl－2和bax蛋白阳性表达率；免疫印迹检测PARP和Caspase3活性。结果处理组与对照组相比细胞凋亡率明显下降， bax蛋白阳性表达百分率明显下调，而bcl－2表达则明显上调（P＜0．05）。对照组PARP和Caspase 3蛋白均出现剪切片断，处理组未发现剪切片断形成。结论 NADH具有抗辐射诱导的L02肝细胞凋亡损伤作用，其作用机制可能通过bcl－2和bax调控线粒体途径有关。
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二烯丙基三硫通过miR-34a调控人白血病细胞中NADPH氧化酶的机制研究
目的:研究二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)对人白血病细胞HL-60细胞中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活性的影响及可能的作用机制.方法:DATS(150 μmol/L)作用于HL-60细胞不同时间后,采用硝基四氮唑蓝(nitro blue-tetrazolium,NBT)还原实验检测NADPH氧化酶的活性;实时荧光定量PCR检测DATS对微RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)以及S rc、Gab1和Shp-2 mRNA表达的影响及miR-34a对Src、Gab1和Shp-2 mRNA表达的影响;蛋白质印迹法检测DATS及miR-34a对Src、Gab1和Shp-2蛋白磷酸化的影响;细胞计数实验检测DATS和miR-34a对HL-60细胞增殖的影响.结果:DATS作用于HL-60细胞后能明显提高细胞中NADPH氧化酶的活性,且呈时间依赖性,而S rc激酶抑制剂PP2可抑制这种作用;DATS能上调HL-60细胞中miR-34a的表达水平,呈时间依赖性;miR-34a过表达可抑制Src、Gab1和Shp-2 mRNA及磷酸化蛋白的表达;DATS能抑制磷酸化Src、Gab1和Shp-2蛋白的表达水平.DATS和miR-34a过表达能抑制HL-60细胞的增殖,而抑制miR-34a的表达则可提高白血病细胞的增殖能力.结论:DATS可能通过促进HL-60细胞miR-34a-Src-Gab1-Shp途径调控NADPH的氧化酶活性,从而起到抑制白血病细胞增殖的作用.
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宫颈鳞癌组织中NRDR选择性剪接新亚型的鉴定及意义
目的:探讨NRDR选择性剪接新亚型NRDRB1 mRNA和蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及其临床意义.方法:采用RT-PCR、免疫荧光、免疫沉淀、免疫印迹、MALDI-TOF质谱分析等技术,检测正常宫颈上皮及宫颈鳞癌组织中NRDRB1mRNA及蛋白表达.结果:NRDRB1亚型全长1 171 bp,其蛋白保留了SDR家族的N末端辅酶结合模序、C末端底物结合模序以及过氧化物酶体定位信号.因第3外显子的缺失,导致SDR家族典型的"LVSNAA"折叠的丢失,使NRDRB1蛋白空间构象发生改变,从而影响该蛋白的细胞内定位和功能,NRDRB1蛋白的亚细胞定位明显不同于NRDR,酶活性亦明显低于NRDR.NRDRB1 mRNA及蛋白在宫颈鳞癌组织中表达(15/27,55.6%),明显高于正常宫颈上皮组织(P＜0.05),正常宫颈上皮除NRDR外,未检测到NRDRB1 mRNA及其蛋白.结论:NRDR选择性剪接的异常,以及新的剪接亚型NRDRB1细胞内定位及蛋白酶活性的改变可能与宫颈鳞癌的发生发展密切相关.
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还原型辅酶NADH对小鼠辐射损伤防护作用的初步实验研究
肿瘤放射治疗对正常组织的损伤已成为放射生物学研究中的重要领域.随着肿瘤放射治疗技术的迅速发展,如适形调强放疗(IMRT),大大减小了肿瘤周边正常组织的损伤和提高了肿瘤靶区的放射剂量,但还是不可避免地对正常组织产生近期和远期的放射反应.因此,研究正常组织的放射防护已成为肿瘤放射治疗急需解决的问题.本研究在前期研究工作基础上,进一步探讨NADH对昆明小鼠外周血、骨髓和肝脾脏器损伤的防护作用.
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尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸对兔快速心房起搏后心房有效不应期的影响
目的观察尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)对急性离体心房颤动模型心房肌有效不应期(AERP)的影响及部分通道mRNA的改变.方法选择新西兰大耳白兔24只,随机等分为正常对照组、起搏对照组、起搏/NADH组、起搏/NADH+Rotenone(NADH氧化还原酶拮抗剂)组.正常对照组和起搏对照组用普通台氏液灌流,起搏/NADH组用含NADH的台氏液灌流,起搏/NADH+Rotenone组用含NADH及Rotenone的台氏液灌流.监测起搏前后(正常对照组为灌流前后)AERP的变化.AERP检测完毕后,取右房心肌组织,行半定量逆转录-聚合酶链式反应RT-PCR测定肌浆网钙泵、L型Ca2+通道、Ryanodine2型受体(RyR2)的相对表达.结果快速心房起搏1 h后,起搏对照组和起搏/NADH+Rotenone组AERP缩短,以起搏对照组变化大;正常对照组和起搏/NADH组起搏前后无明显变化.同时,快速心房起搏使肌浆网钙泵和L型Ca2+通道表达下调,RyR2受体表达上调;起搏/NADH+Rotenone组L型Ca2+通道表达下调,RyR2表达上调而肌浆网钙泵的表达无明显改变;而起搏/NADH组各相关基因表达无明显改变.结论 NADH能够抑制快速心房起搏时心肌的电重构,其作用可能是通过促进肌浆网钙泵基因的表达和抑RyR2介导的Ca2+释放来实现的.
关键词： 电生理学 快速心房起搏 Langendorff灌流 电重构 NADH -
NADH对抗X射线诱导正常肝细胞凋亡的实验研究
许多因素能够诱导细胞凋亡,如电离辐射、紫外线、低氧、缺血、中毒及化疗药物等;利用某种药物增加肿瘤细胞凋亡和减少正常细胞凋亡对于肿瘤防治具有重要意义.近年来,对癌症放化疗中正常组织保护的研究主要集中在氨基硫醇类和非硫醇类药物的作用研究,如氨基硫醇类WR-2721、WR-1065、细胞因子、植物多糖、抗氧化维生素类等[1].虽然WR-2721仍为有效的抗放疗或/和化疗的细胞保护剂,但其自身的不良反应限制了常规应用.本研究通过NADH对X射线诱导正常肝细胞株L02细胞凋亡的影响,旨在探讨一种新型的抗辐射细胞保护药物.
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NADH对辐射诱导正常肝细胞株L02损伤时细胞凋亡的影响
目的研究抗氧化剂NADH对5.0 GyX射线照射正常细胞的防护作用.方法处理组于5.0 Gy X射线照射后立即加入NADH,一次给药,剂量为100～600 μg/ml,分别观察培养6、12、24 h后凋亡细胞率及p53和Bcl-2蛋白表达,并且与照射后加入RPMI 1640组和假照射组比较.结果NADH抑制细胞凋亡率呈剂量依赖性,在浓度为400～600 μg/ml时达平台,并且能够上调Bcl-2蛋白表达,下p53蛋白表达,差异非常显著(P＜0.01).结论NADH对受照L02肝细胞有明显的防护作用,但其作用机制还需进一步研究.
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NADH对昆明小鼠辐照后造血系统的影响
目的探讨NADH对小鼠辐照后造血系统的影响.方法昆明小鼠60只,随机分为3组,每组20只,实验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组分别为正常对照组、辐照前注入生理盐水组和辐照前注射NADH药物组.生理盐水和NADH药物均采用腹腔注射,2次/d,照射前3 d给药.辐照采用6.0Gy 60Co一次性辐照小鼠.尾静脉采血计数连续观察辐射后不同时期对外周血白细胞总数的影响;辐照后24 h,取股骨骨髓涂片,显微镜下计算骨髓有核细胞数和其分裂指数;通过DNA琼脂糖凝胶电泳观察昆明小鼠辐照后24、48 h骨髓细胞凋亡的改变.结果NADH能够抑制受照后小鼠外周血白细胞减小,增加骨髓有核细胞数及分裂指数,但并不能抑制DNA凋亡片段形成.结论NADH能够明显抑制辐射诱导的造血系统损伤,但并不通过抑制骨髓细胞凋亡途径.
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NADH抗紫外线诱导的肝细胞株L02凋亡
目的研究还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)抗紫外线照射所致的细胞损伤的分子机制.方法采用UVB紫外线照射正常肝细胞株L02(照射剂量为200 J/m2),实验组加/对照组不加NADH(400μg/ml)培养24 h.AnnexmV/PI法检测细胞凋亡率,DNA凝胶电泳观察DNA断裂片断,流式细胞仪检测p53、Bcl-2、Bax蛋白表达 .结果NADH可明显抑制紫外线诱导的肝细胞凋亡,并且能够上调Bcl-2蛋白表达,下调p53、Bax蛋白表达.经紫外线照射后的肝细胞存在自身修复.结论NADH能够抗紫外线诱导的细胞凋亡,其机制可能与上调Bcl-2,下调p53、Bax表达有关.
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辅酶NADH对放射后外周血免疫细胞的影响
目的研究辐射后淋巴细胞亚群变化及其NADH对免疫细胞表型的影响.方法分离8例健康人群外周血淋巴细胞,每例分3组,第一、二、三组分别为不照射组、照射后不加药组和照射后加入NADH组.采用FCM分析细胞亚群及IL-2受体表达率.结果实验Ⅱ组与实验Ⅰ、Ⅲ组相比CD4/CD8比值减小,CD3、CD4、NK细胞百分率下降,CD8百分率增加,IL-2受体表达下调(P＜0.05).结论 NADH体外能够提高机体的免疫功能.
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还原型辅酶NADH对辐射后小鼠外周血及脾组织学改变的影响
目的探讨NADH对小鼠受照后,外周血白细胞和免疫器官脾组织学改变.方法采用6.0 Gy 60Co一次性辐射小鼠,尾静脉采血计数外周血白细胞,观察受照后第7天脾组织学改变和30d小鼠存活率.结果NADH能够对抗受照后小鼠外周血白细胞减小,增加脾重量和脾指数,减小脾中央动脉出血,提高小鼠30d存活率.结论NADH具有明显的抗辐射作用,但还需进一步研究.
