蝎Na+通道毒素的结构及功能研究进展

蝎Na+通道毒素为低分子量肽类物质,由60～76个氨基酸残基组成,含有4对二硫键.这类分子为电压门控Na+通道功能门控机制的高亲和性配体,具有重要的理论价值和应用前景.本文对Na+通道毒素的初级和高级结构、药理学特性及功能解剖等方面的研究结果进行了综述.

东亚钳蝎毒素多肽对家兔单个心室肌细胞钠电流作用的实验研究

蝎毒素对C57BL/6小鼠Lewis肺癌生长及免疫细胞的影响

目的:观察蝎毒素(ITX)对Lewis肺癌生长及对荷瘤小鼠免疫细胞的影响.方法:建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型后,随机分为模型组、rIL-2组、ITX组、空白组,每组8只小鼠,接种第2日起,每天腹腔注射给药,连用16天.末次给药24h后,用流式细胞术检测小鼠外周血中免疫细胞的功能状态；酶联免疫法检测小鼠外周血TGF-β1水平,并测量瘤体质量和体积.结果:ITX干预后荷瘤小鼠单核、NK和B细胞均有一定活化,但无统计学意义；rIL-2干预后荷瘤小鼠的NK和B细胞有明显活化(P＜0.05);ITX组和rIL-2组血清TGF-β1水平均高于模型组,rIL-2组明显高于模型组(P＜0.05)；ITX和rIL-2干预后瘤体质量和体积均有增加,ITX组明显高于模型组(P＜0.05).结论:ITX和rIL-2均促进了瘤体质量和体积的增加,可能与其活化的免疫细胞有关.

重组蝎毒素基因表达的研究进展

目的介绍重组蝎毒素基因表达的研究进展.方法根据近年来国内外公开发表的有关研究论文,综述重组蝎毒素基因表达的研究. 结果与结论通过筛选得到的蝎毒素基因或化学合成的编码蝎毒素的基因分别在大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫和植物中都有过表达尝试.重组蝎毒素基因表达的关键是如何使有活性的重组蛋白高水平表达.

东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽体外靶向肝细胞癌的实验研究

背景:肝细胞癌(HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一,目前手术、介入、放化疗等常规治疗效果均不理想,开发有效、毒副作用相对较小的新约成为研究者关注的重点.目的:观察东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽(AGAP)基因真核表达载体对HCC细胞的靶向表达和毒性作用.方法:真核表达质粒pAFP-AGAP经酶切和测序鉴定后转染甲胎蛋白(AFP)阳性人HCC细胞株HepG2以及AFP阴性人宫颈癌细胞株HeLa和正常人肝细胞株LD2.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AGAP mRNA表达,CCK-8方法检测细胞毒性作用.结果:各组细胞转染质粒pAFP-AGAP后,AGAPmRNA表达仅见于AFP阳性HepG2细胞,而AFP阴性HeLa细胞和L02细胞均无AGAP mRNA表达.HepG2细胞转染质粒pAFP-AGAP 48 h后形态发生明显改变,细胞生长显著受抑(P<0.01),48 h和72 h时抑制率分别为44.4%和74.6%.而HeLa细胞和L02细胞的形态和生长均未受明显影响.结论:AGAP基凶真核表达载体可实现HCC基因治疗的靶向性和高效性,有望成为HCC靶向基因治疗的有力工具.

一种源自北非蝎的抗昆虫毒素Am IT的结构与功能鉴定

本研究主要分离和鉴定了一种源自北非蝎被称为Am IT的新毒素.详细分析了Am IT对昆虫神经索钠电流的调节效应.Am IT经凝胶过滤纯化后通过C18反相高效液相色谱法纯化.采用雄性德国蟑螂(德国小蠊)的幼虫和C57/BL6小鼠进行AmIT体内毒性分析.Am IT与两种β毒素的竞争实验则采用125I修饰的毒素通过与大鼠脑突触体膜的放射免疫法测定.Am IT的氨基酸序列通过Edman降解法测定.在结合实验中,Am IT被观察到与另一种源自北非蝎的毒素AaH IT4存在竞争效应.而且它可以被β型毒素的抗体识别,由此说明它与β型毒素(或相关毒素家族)的结构相似.新毒素显示了双重的活性,它既能与抗哺乳动物毒素在结合实验中竞争,又能促使昆虫躯体产生收缩反应.该毒素能够竞争携带放射标记的β毒素Css Ⅳ与大鼠突触体膜钠通道的结合.通过氨基酸序列分析,Am IT显示出与AaH IT4有92％的同源性.以上结果说明,Am IT不但显示了隶属于旧大陆的抗昆虫毒素的性质,表现为结合于昆虫的钠通道;而且它与隶属于新大陆的抗哺乳动物毒素类似,表现为对小鼠的毒性.因此,Am IT与AaH IT4在结构与功能上是极为类似的.

东亚钳蝎Na+通道毒素BmkNaTx12的基因克隆与重组表达

利用野生东亚钳蝎毒腺构建cDNA文库,并通过序列比对确定了一条全新的Na+通道长链毒素BmkNaTx12并克隆出其全长cDNA序列.序列比对显示BmkNaTx12的序列与墨西哥毒蝎的β-毒素Cn12具有较高的结构相似性,通过同源模型构建并选取打分高的模型得到BmkNaTx12的预测结构,经分子动力学优化发现蛋白结构在300 ns趋于稳定,而蛋白20、35、52个氨基酸处的波动很可能由于这些氨基酸所处位置在loop区域导致.进一步构建了BmkNaTx12-Fc融合蛋白重组表达系统,通过Western blot技术确定重组蛋白佳表达时间,并在HEK293细胞中成功表达出BmkNaTx1 2-Fc融合蛋白.经蛋白A亲和色谱纯化后获得的重组融合蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳及高效液相鉴定后纯度高达95％.此外,全细胞膜片钳实验结果显示:BmkNaTx12-Fc在1μmol/L浓度下能增大20％ Nav1.7峰电流.研究结果为后续的生物学功能研究奠定了理论基础.

重组CD13单链抗体/蝎毒素AGAP原核表达质粒的构建

目的:构建pRSETA/AGAP/CD13scFv重组表达质粒,为重组CD13单链抗体/蝎毒素AGAP融合蛋白的表达奠定实验基础.方法:利用RT-PCR法从东亚钳蝎尾腺中获得AGAP目的基因,并与克隆质粒TOPO载体连接转入DH5α菌,用EcoR I和Hind III将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒 pRSETA连接;在含CD13单链抗体(CD13scFv)的pSecTag2HygroC/CD13 -1/RFP质粒中获得CD13scFv目的基因,用EcoR I、Xho I双酶切并与同样双酶切后的pRSETA/AGAP连接转入DH5α菌,提取重组质粒进行酶切及测序鉴定.结果:目的基因AGAP与表达质粒pRSETA连接,成功构建了pRSETA/AGAP重组质粒;目的基因CD13scFv再与该重组质粒连接,成功构建了pRSETA/AGAP/CD13scFv.结论:AGAP目的基因能经RT-PCR法获得,并能成功与表达质粒连接,构建pRSETA/AGAP;目的基因CD13scFv能由pSecTag2HygroC质粒中获得,并成功与pRSETA/AGAP连接,得pRSETA/AGAP/CD13scFv重组质粒.为该重组质粒体外融合蛋白的表达及今后研究CD13scFv和蝎毒素AGAP协同性杀伤CD13阳性肿瘤细胞提供了良好的实验基础及理论依据.

蝎毒多肽提取物抑制胰腺癌肝转移作用的实验研究

目的 探讨东亚钳蝎蝎毒多肽提取物(PESV)对胰腺癌肝转移的抑制作用.方法 筛选出高肝转移的胰腺癌细胞亚型MIA-PaCa2-3,用Transwell小室模型观察PESV对MIA-PaCa2-3细胞体外侵袭能力的影响;尾静脉注射MIA-PaCa2-3细胞建立高肝转移率的裸鼠胰腺癌模型,对比PESV和化疗药物吉西他滨(gemcitabine)以及抗血管生成剂TNP-470对裸鼠胰腺癌肝转移的抑制作用. 结果 PESV可以抑制MIA-PaCa2-3细胞穿过人工基底膜的能力;PESV处理组肝转移抑制率为70%(7/10),与吉西他滨处理组相近(8/10),明显高于TNP-470处理组(2/9).结论 PESV作为一种"抗血管-细胞毒"药物对胰腺癌肝转移具有明显的抑制作用.

蝎毒素ITX氨基酸含量及蛋白质组分分析

目的:测定蝎毒素ITX样品中17种氨基酸的含量,分析并鉴定其中某些蛋白质组成成分.方法:将常压柱分离得到的蝎毒素蛋白ITX利用L-8800氨基酸分析仪进行氨基酸含量分析;以17 cm pH 3～10固相pH梯度胶条(IPG)为第一向IEF,18%SDS聚丙烯酰胺凝胶为第二向进行双向电泳;PDQuest 7.1.1分析软件分析电泳图谱,筛选目的蛋白,然后对重现性和稳定性良好的蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-Ms)和串联质谱(MS/MS)分析,得到肽质量指纹图谱(PMF)数据,登录网站http://www.matrixscience.com.用Mas-cot程序检索NCBInr数据库,鉴定蛋白质.结果:ITX 17种氨基酸的含量从0.14%-11.35%不等;从蝎毒素ITX蛋白样品中共筛选出9个等电点不同,相对分子质量约为5800的蛋白点,其中蛋白点1、2、3、4位于酸性区,蛋白点5、6、7、8、9位于碱性区.获得了4、6号蛋白点多肽的PMF数据.结论:测定了蝎毒素ITX蛋白的氨基酸含量;建立蝎毒素ITX蛋白质组学研究方法,为后续工作奠定了基础.

蝎毒素结构与功能研究进展

蝎毒素是一类具有特殊生物活性的多肽物质.近年来,国内外对蝎毒素的结构与功能研究取得了巨大成就,已测得的蝎毒素结构已有百余种之多,α/β模体基本结构的确立,为蝎毒素的进一步研究和新药开发提供了广阔的前景,倍受学术界的重视;结合结构特点,对其功能进行研究,取得了不错的成绩.

BmkTXK β对家兔心房肌细胞钾电流的影响

为研究东亚钳蝎毒素BmkTXK β对家兔心房肌单细胞电生理特征的影响,应用全细胞膜片钳技术记录各项钾电流和动作电位. 结果:BmkTXK β呈浓度依赖性地延长动作电位时程(APD20、APD50和APD90),但对动作电位幅度(APA),静息膜电位(RMP)和0相大除极速度(Vmax)无明显影响(n=9).在刺激电压+50 mV时1 μmol/L 的BmkTXK β使心房肌细胞瞬间外向钾电流(Ito)从13.63±0.87 pA/pF减少到7.98±0.78 pA/pF,抑制率为41.4%(n=10,P<0.01).同时,这种作用具有显著的浓度依赖性,抑制50%的电流所需浓度(IC50)的均值为0.95 μmol/L.BmkTXK β可抑制延迟整流性钾电流(IK),表现为剂量依赖性阻断的形式.10 μmol/L时(刺激电压+70 mV),它对IK的抑制率为39.3%(从5.86±0.64 pA/pF降到3.56±0.58 pA/pF,n=6,P<0.05).IC50的均值为2.76 μmol/L.但BmkTXK β对内向整流钾电流(IK1)的电流幅值及其反转电位基本无影响(n=6,P>0.05). 结论: BmkTXK β阻断Ito和IK等与心脏复极相关的钾离子通道,且能在多个环节显著延长APD.

东亚钳蝎毒素多肽对家兔单个心室肌细胞钠电流作用的实验研究

目的为了研究基因表达得到的与钠通道位点3或4结合而分别起激活或抑制作用的东亚钳蝎毒素(BmK)α和β多肽对钠通道作用的生物学特性.

以氯离子通道蝎毒素为靶分子的分子影像研究进展

分子影像学是利用影像学手段研究在体条件下细胞内的正常或病理状态分子过程,在分子或细胞水平反映生物体生理、病理变化,为疾病过程在体监测、基因治疗在体示踪、药物在体疗效评测和功能分子在体活动规律研究提供新的技术,具有无创、实时、在体、特异、精细显像等优点[1].主要实现手段是核医学技术、MRI、超声及光学成像技术.其成像原理是借助分子探针,通过靶向结合或酶激活的原理及适当的扩增策略放大信号后,高分辨力的成像系统就可以检测到相应的信号改变,从而间接反映分子或基因的信息.对于分子影像学,重要的是采用合适的探针和成像系统.

免疫抑制蝎毒活性肽Im169的重组表达和功能鉴定

目的:筛选鉴定新型蝎毒免疫活性肽.方法:从海南斑等蝎(Isometrus maculates)毒腺组织cDNA文库中筛选和分离蝎毒肽基因,通过GST融合蛋白表达纯化、肠激酶酶切和高压液相色谱(HPLC)分离的方法,获得色谱纯重组蝎毒活性肽,酶联免疫吸附(ELISA)实验检测细胞因子,鉴定免疫调节活性.结果:筛选得到一个新的蝎毒活性肽基因Im169,其编码的成熟肽由29个氨基酸组成,其中含有6个半胱氨酸.Im169多肽对T淋巴细胞IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的分泌具有明显的抑制作用,且作用呈浓度依赖性(P＜0.05).序列分析显示:Im169多肽和蝎钾通道毒素的相似性高,提示其是一个潜在的钾通道毒素多肽.功能机制分析显示:Im169多肽通过抑制T细胞表面的钾通道,从而发挥免疫抑制功能.结论:发现了一个新的蝎毒免疫调节肽,丰富了对蝎毒活性肽的功能认识,为自身免疫疾病的药物开发提供了新的多肽模板.

1例蝎酒外用致中毒患儿的护理

蝎毒是一种蛋白质蝎毒素,对呼吸中枢有麻痹作用,对心血管有兴奋作用,严重者可致死[1].此外尚可发生出血及溶血,偶有引起胰腺炎和血糖升高.蝎毒中毒病例多因蝎蜇伤引起,一般蝎蜇伤后局部有灼痛、麻木、红肿,出现水疱和出血,可出现头晕、头痛、神志模糊、电解质紊乱、凝血功能障碍、全身不适、心动过缓、出汗、少尿、嗜睡、肌肉麻痹、胃肠道出血及呼吸中枢麻痹等,或有低血压和肺水肿.2011年6月,我科收治1例蝎子泡酒外用所致中毒患儿,现将护理经过报道如下.

蝎毒抗癌多肽对大肠癌细胞LoVo的影响及其与化疗药物的协同作用

目的：探讨东亚钳蝎蝎毒抗癌多肽对大肠癌细胞LoVo的影响及其与多种化疗药物的联合作用。方法：采用MTT法，测定蝎毒抗癌多肽与各种化疗药物对LoVo细胞的增殖抑制作用以及蝎毒抗癌多肽与化疗药物联合对LoVo细胞的增殖抑制作用。结果：蝎毒抗癌多肽可抑制LoVo细胞增殖，并可诱导其凋亡。低浓度的蝎毒抗癌多肽与化疗药物联合用药，可产生较强的抑制细胞增殖的作用。结论：蝎毒抗癌多肽具有直接的抗肿瘤作用，并且具有可以增强化疗药物作用的功能。

蝎毒对马桑内酯所致癫（间）大鼠的作用

目的:研究蝎毒素对癫（间）的作用,为新药的开发利用提供理论基础.方法:采用整体马桑内酯大鼠癫（间）模型,侧脑室埋管给药,记录皮层脑电图.结果:蝎毒素能延长马桑内酯所致癫（间）发作的潜伏期,降低发作程度,缩短发作时间.结论:蝎毒素对马桑内酯所致的大鼠癫（间）具有对抗作用.