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mTOR/Akt/FoxO3信号通路在人参皂苷Rg1抗PC-12细胞OGD损伤的作用
目的:研究人参皂苷Rg1对PC-12细胞缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤的保护作用,并初步探讨与mTOR/Akt调控FoxO3核浆穿梭相关的可能的分子机制.方法:建立OGD损伤PC-12细胞模型,MTT 法检测OGD对PC-12细胞存活率.人参皂苷Rg110,20,40 μmol·L-1预处理PC-12细胞24h,加OGD损伤,MTT 检测细胞存活率,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量.Western blot法检测mTOR,p-Aktser473,p-Aktthr308,Akt,p-FoxO3,细胞核、细胞质FoxO3和总FoxO3蛋白表达.结果:OGD作用4～24h显著抑制PC-12细胞增殖,呈时间依赖性.Rg1(20,40 μmol·L-1)预处理24h可显著增加细胞存活率,减少LDH释放,增加SOD活力和降低MDA含量.Rg1可抑制由OGD引起的rmTOR,p-Aktser473表达降低.OGD 6 h可减少FoxO3磷酸化,并促进细胞质FoxO3进入细胞核;预处理Rg1增加FoxO3磷酸化,促进FoxO3进入细胞质.提示Rg1可经由调控mTOR/Akt/FoxO3信号通路抑制PC-12细胞损伤.结论:人参皂苷Rg1可抑制OGD引起PC-12细胞损伤,作用机制可能与激活mTOR/Akt信号通路调控FoxO3核质穿梭密切相关.
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缺血后适应调控树鼩脑缺血海马CA1区Akt(pS473)和Akt(pT308)过磷酸化的抗凋亡机制
目的 观察树鼩脑缺血海马神经元Akt(pS473)和Akt(pT308)磷酸化改变对CA1区细胞凋亡的影响,探讨缺血后适应(PC)抑制细胞凋亡的可能机制.方法 用光化学诱导法诱导树鼩脑缺血并建立缺血PC模型;用免疫组织化学TACS原位凋亡检测试剂盒检测皮层及海马CA1区神经元凋亡数量,用免疫组织化学法检测Akt(pS473)和Akt(pT308)表达的空间分布,用ELISA法检测海马CA1区神经元Akt(pS473)和Akt(pT308)磷酸化水平;用电子显微镜观察其神经元超微结构改变.结果 脑缺血后神经元皱缩,核消失以缺血24h为著.脑缺血后4h、24 h及72 h皮层及海马CA1区神经元TUNEL阳性细胞数明显增加(P＜0.01),海马CA1区神经元Akt(pS473)和Akt(pT308)的表达及磷酸化水平明显升高,以脑缺血4h的改变明显,分别为(152.3±3.5)units/mg、(130.8±2.6)units/mg和(149.5 ±4.7) units/mg和(42.35 ±2.49) units/mg、(19.23±1.41) units/mg和(23.38±1.32) units/mg (P ＜0.01).缺血PC组神经元损伤明显减轻,皮层及海马CA1区TUNEL阳性细胞明显减少(P＜0.01),且与海马神经元Akt(pT308)活化水平呈平行改变(P＜0.05).结论 树鼩脑缺血海马CA1区细胞凋亡与Akt(pS473)和Akt(pT308)过磷酸化的信号机制有关,缺血PC抑制海马神经元Akt(pS473)和Akt(pT308)双磷酸化可能具有抗凋亡作用.
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肝癌组织Survivin和p-Akt及ER表达及其临床意义分析
目的:研究原发性肝细胞癌组织和癌旁组织中存活素(Survivin)、磷酸化Akt(p-Akt)和雌激素受体(ER)表达及意义.方法:应用蛋白质印迹法检测52例原发性肝细胞癌和8例正常癌旁组织中Survivin、P-Akt和ER的表达.结果:肝细胞癌组织中Survivin和p-Akt表达明显高于癌旁组织,Survivin和p-Akt的表达与肝癌患者术后复发呈阳性相关(P＜0.05),且两者之间的表达也呈阳性相关(r=0.736,P＜0.01),而ER在两种组织中表达相仿,与肝癌患者术后复发无相关性,P＞0.05.多因素分析结果显示,肿瘤转移、Survivin和p-Akt阳性表达可作为肝癌复发的风险因子.结论:Survivin和p-Akt与原发性肝癌的发生发展关系极为密切,Survivin和p-Akt高表达者预后差,可作为肝癌预后的预测因子.
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黄芪多糖对基底细胞样乳腺癌细胞增殖和Akt磷酸化的影响
目的:观察黄芪多精对基底细胞样乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞增殖和Akt蛋白磷酸化的影响.方法:用不同浓度的黄芪多耱(Astragalus polysaccharide,APS)干预MDA-MB-468细胞,用甲基噻唑基四唑法检测不同浓度APS干预对MDA-MB-468细胞增殖的量效和时效关系.用细胞内蛋白质印迹法检测APS干预MDA-MB-468细胞株l、2、4和7d后对磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt) (Thr308)和p-Akt (Ser473)蛋白表达水平的影响,以及p53/鼠双微体2(murine double minute 2,MDM2)信号转导通路中的关键靶点p53、MDM2和人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)蛋白表达水平的影响.用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术沉默PTEN的表达,用细胞内蛋白质印迹法检测APS干预MDA-MB-468细胞2d对p-Akt(Thr308)和p-Akt(Ser473)蛋白表达水平的影响.结果:1和0.5 mg/mL的APS对MDA-MB-468细胞的增殖有明显的抑制作用.1和0.5 mg/mL的APS干预1、2、4和7d后能下调p-Akt(Thr308)的表达;干预1和2d后下调p-Akt(Ser473)的表达,上调MDM2蛋白的表达；干预7d后上调p53和PTEN蛋白的表达.PTEN沉默后,APS在干预2d后对p-Akt(Thr308)和p-Akt(Ser473)的表达没有影响,细胞增殖的抑制率低于PTEN未沉默时.结论:APS能抑制MDA-MB-468细胞的增殖,下调MDA-MB-468细胞Akt磷酸化的水平,其抑制MDA-MB-468细胞增殖的机制可能与通过对p53/MDM2正负反馈环的调节从而上调p53和PTEN蛋白的表达有关.
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基质金属蛋白酶-3促进骨肉瘤MG-63细胞的增殖、侵袭及其可能的机制
目的:研究基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)对骨肉瘤细胞增殖、侵袭的影响,并初步探讨MMP-3促进骨肉瘤侵袭和转移的机制.方法:收集2013年1月1日至2013年11月1日期间解放军第184医院骨科收治的骨肉瘤患者40例和健康人40名的血液标本,ELISA法检测其中MMP-3含量,并采用SPSS软件分析MMP-3含量与骨肉瘤Enneking分期的相关性.RT-PCR分别检测不同骨肉瘤细胞株U2-OS、HOS-143b、MG-63中MMP-3的表达.MTT法、Transwell侵袭实验观察50、100、200 ng/ml MMP-3刺激或转入MMP-3-shRNA慢病毒(MOI=50、100、200)对MG-63细胞增殖和侵袭的影响,Western blotting方法检测MMP-3过表达或沉默对MG-63细胞中侵袭、转移相关的蛋白p-AKT、核蛋白NF-κB表达的影响.结果:骨肉瘤患者血清中MMP-3的含量高于正常人(F=186.4,P=0.000);且MMP-3含量与骨肉瘤Enneking分期成正相关(r =0.736,P=0.043).与其他3株细胞相比,MG-63细胞株中MMP-3表达高(t=5.12,P＜0.05).MMP-3刺激导致MG-63细胞内MMP-3过表达,p-AKT和核内NF-κB表达升高,并促进MG-63细胞的增殖和侵袭;转入MMP-3-shRNA慢病毒导致MMP-3表达沉默,p-AKT和核内NF-κB表达降低,抑制MG-63细胞的增殖和侵袭.结论:MMP-3可能通过增加AKT磷酸化水平和促进NF-κB核转位来促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭.
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肌动蛋白细丝桥梁蛋白(Girdin)在垂体瘤中的表达及促细胞增殖作用
目的 检测肌动蛋白细丝桥梁蛋白(Girdin)在垂体瘤中的表达,并探讨其促进细胞增殖的作用及相关分子机制.方法 收集泌乳素腺瘤、生长激素腺瘤和无功能垂体瘤样本各2例,以及正常垂体样本1例.分别提取各样本组织蛋白,用蛋白质印迹法检测样本中Girdin的表达水平,并用免疫荧光实验进一步验证.通过过表达和RNA干扰Girdin分别构建Girdin过表达和敲低的大鼠垂体瘤细胞系GH3细胞模型.用蛋白质印迹法检测Girdin过表达或敲低的GH3细胞中的Girdin和Akt蛋白及其磷酸化水平.通过细胞增殖实验和凋亡实验研究Girdin在垂体瘤中的功能和生物学行为.结果 蛋白质印迹分析结果显示Girdin在无功能垂体瘤中表达高,生长激素腺瘤次之;免疫荧光实验也验证了Girdin在无功能垂体瘤中的高表达.过表达和RNA干扰实验分别提高和敲低了GH3细胞中Girdin的表达水平,Akt的磷酸化水平也发生同样变化.此外,Girdin的过表达能够促进GH3细胞增殖.结论 Girdin在无功能垂体瘤中高表达,并通过调控Akt磷酸化水平促进垂体瘤细胞的增殖.
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外源性信号素3A信号通路对转化生长因子-β1诱导肺癌细胞侵袭、增殖的影响
目的:探讨外源性信号素3A(Sema 3A)信号通路对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺癌A549细胞侵袭、增殖的影响及可能作用机制.方法:将肺癌A549细胞分为3组,即空白对照组、TGF-β1诱导组(TGF-β1组)、Sema 3A预处理组(Sema 3A+TGF-β1组).空白对照组细胞正常培养;TGF-β1组加入5μg·L-1 TGF-β1;Sema 3A +TGF-β1组首先加入10 μmol·L-1 Sema 3A,预处理40 ～ 50 min后再加入5 μg·L-1TGF-β1.检测细胞增殖、侵袭能力和E-cadherin、Akt、P-Akt蛋白表达.结果:Sema 3A+TGF-β1组细胞Se-ma 3A mRNA相对表达水平显著高于空白对照组和TGF-β1组(均P＜0.05).培养36 h～ 72 h内,TGF-β1组细胞增殖率显著高于Sema 3A+ TGF-β1组和空白对照组(均P＜0.05),Sema 3A+ TGF-β1组细胞增殖率显著高于空白对照组(均P＜0.05).TGF-β1组穿透滤膜细胞数显著高于Sema 3A+ TGF-β1组和空白对照组(均P ＜0.05),Sema 3A+TGF-β1组穿透滤膜细胞数显著高于空白对照组(P＜0.05).TGF-β1组E-cadherin蛋白表达显著低于Sema 3A+TGF-β1组和空白对照组(均P＜0.05),P-Akt蛋白显著高于Sema 3A+TGF-β1组和空白对照组(均P ＜0.05);Sema 3A+TGF-β1组E-cadherin蛋白表达显著低于空白对照组(P＜0.05),P-Akt显著高于空白对照组(P＜0.05).结论:Sema 3A能够抑制TGF-β1诱导肺癌细胞侵袭、增殖的效应,其机制可能与抑制Akt磷酸化、上调E-cadherin表达有关.
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木瓜蛋白酶对MPA诱导的单核细胞分泌和黏附功能的抑制作用及分子机制初步研究
目的:观察木瓜蛋白酶对单核细胞-血小板聚集物(MPA)诱导的单核细胞分泌和黏附功能的抑制作用,并初步探讨其分子机制.方法:分离人外周血单核细胞和富血小板血浆(PRP),检测20 U/L木瓜蛋白酶不同作用方式下凝血酶和花生四烯酸(AA)诱导的MPA形成及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平.将实验分为0(对照)、20、80U/L木瓜蛋白酶组,分别以ELISA、流式细胞术和显微镜检查测定木瓜蛋白酶与单核细胞共孵育后MPA诱导的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和组织因子(TF)释放、CD11b和CC趋化因子受体2(CCR2)表达水平以及单核细胞与人脐静脉内皮细胞黏附率,再以Western blot检测单核细胞Akt磷酸化(p-Akt)和环氧化酶-2(COx-2)表达水平.结果:20 U/L木瓜蛋白酶与单核细胞和血小板共孵育时显著降低凝血酶和AA诱导的MPA形成和TNF-α水平(P＜0.01).20 U/L木瓜蛋白酶组MCP-1和TF水平,CD11b和CCR2表达率,单核细胞与内皮细胞黏附率均显著低于对照组(P＜0.01),80 U/L组对五者的抑制率显著高于20 U/L组(P＜0.01).木瓜蛋白酶显著抑制p-AKT和COX-2表达,80 U/L组p-Akt和COX-2光密度比值显著低于20 U/L组(P＜0.01).结论:木瓜蛋白酶可通过抑制Akt磷酸化和COX-2表达途径而抑制MPA诱导单核细胞活化后的释放和黏附功能,从而可能有助于预防动脉粥样硬化.
关键词： 木瓜蛋白酶 单核细胞-血小板聚集物 单核细胞活化 Akt磷酸化 环氧化酶-2 -
抑制Sema 4D表达介导的成骨前体细胞AKT磷酸化水平上调在乳腺癌骨转移中的作用
目的 探讨抑制Sema 4D介导的成骨前体细胞AKT磷酸化水平上调在乳腺癌骨转移中的作用.方法 通过siRNA技术构建稳定的Sema 4D低表达人乳腺癌MCF-7细胞株,采用实时荧光定量PCR检测细胞Sema 4D mRNA表达,MTT法检测各组细胞增殖能力,Transwell法检测各组细胞侵袭能力;采用Transwell小室建立成骨细胞和乳腺癌细胞的共培养体系,茜素红染色实验检测骨矿化能力,Western blot检测AKT、p-AKT蛋白表达.结果 MCF-7细胞Sema 4D mRNA相对表达量显著高于Hs578Bst细胞(P＜0.05).Sema 4D siRNA转染后,Sema 4D siRNA组Sema 4DmRNA相对表达量显著低于Control组和NC组(均P＜0.05),Control组和NC组Sema 4D mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P＞0.05).Sema 4D siRNA组细胞增殖率显著低于NC组和Control组(均P＜0.05),Sema 4D siR-NA组细胞侵袭率亦显著低于NC组和Control组(均P＜0.05).MCF-7+ OM组和Sema 4D siRNA+OM组骨结节面积显著低于Control+ OM组(均P＜0.05),Sema 4D siRNA+ OM组骨结节面积显著高于MCF-7+ OM组(均P＜0.05).Control+OM组、MCF-7+ OM组、Sema 4D siRNA+OM组AKT蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);MCF-7+OM组和Sema 4D siRNA+OM组p-AKT蛋白表达水平显著低于Control+OM组(均P＜0.05),Sema 4D siRNA+ OM组p-AKT蛋白表达水平显著高于MCF-7+ OM组(P＜0.05).结论 人乳腺癌细胞系MCF-7 Sema 4D表达显著上调,并与细胞增殖、侵袭等生物学行为有关;下调Sema 4D表达,能够提高AKT磷酸化水平,减弱对成骨细胞分化的抑制作用.
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PTEN及其突变体对胃癌细胞AKT磷酸化的影响
目的 研究第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)及其磷酸酶区域突变后对胃癌细胞AKT磷酸化的影响.方法 分别转染野生型PTEN(wild-type PTEN,wtPTEN)质粒、脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性均突变的PTEN-C124S质粒、仅脂质磷酸酶活性突变的PTEN-G129E质粒至AGS细胞和BGC-823细胞.血清饥饿过夜后予各组细胞加入胰岛素或者重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)刺激,后Western blot法检测AKT磷酸化水平.结果 胰岛素和rhEGF均能刺激细胞引起AKT磷酸化,过表达PTEN基因能抑制胰岛素或rhEGF刺激引起的AKT磷酸化(P<0.05),转入功能性突变体PTEN-C124S或PTEN-G129E对AKT磷酸化无抑制作用(P>0.05).结论 PTEN在胃癌细胞中能抑制胰岛素或rhEGF刺激引起的AKT磷酸化,其磷酸酶结构域N端第124或129位氨基酸发生点突变后无抑制作用.
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大肠癌细胞PARG、PARP 与AKT磷酸化状态的关系
目的:聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶[Poly(ADP-ribose) glycohydrolase,PARG]可通过影响聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[Poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]和蛋白激酶B[protein kinase B,AKT]磷酸化在炎症中发挥重要作用,但在肿瘤中的作用却不清楚.本研究则对大肠癌细胞系LOVO中PARG、 PARP、NF-κB和AKT磷酸化的相互关系进行了初步探讨.方法:Western blot法检测LOVO细胞PARG、PARP、NF-κB、AKT和PI-AKT473的蛋白表达.以丹宁酸为PARG抑制剂. 结果:PARG抑制剂丹宁酸处理组LOVO 细胞PARG、PARP、NF-κB表达降低,而PI-AKT473表达则增强,较对照组(无丹宁酸处理组)比较差异均具有显著意义(P=0.006 8,P<0.000 1,P <0.05,P=0.000 8).且PARG和PARP蛋白的表达呈正相关(r=0.823 8,P<0.05),PARG和PI-AKT473的蛋白表达呈负相关(r=-0.819 0,P<0.05). 结论:在大肠癌细胞株中,抑制PARG可以下调PARP和NF-κB,并可增强AKT的磷酸化.其在肿瘤浸润转移中,可能具有重要作用.
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shRNA干扰PARG对大肠癌CT26细胞粘附因子表达的影响
目的:探讨小鼠大肠癌CT26株中聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶[Poly(ADP-ribose) glycohydrolase,PARG]对细胞间粘附因子表达的影响及其可能的机制.方法:以慢病毒为载体对CT26细胞株中PARG基因进行RNA沉默干扰,并筛选出稳定表达株.Realtime-PCR法检测沉默效果.Western blot法检测CT26细胞PARG、PARP、NF-κB和Pi-AKT(473)、ICAM-1、P-selectin 的蛋白表达.结果:实验组与对照组(包括阴性对照组、空载体对照组)相比,PARG、PARP、Pi-AKT(473)、NF-κB、ICAM-1、pselectin表达经统计学分析差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:在大肠癌细胞株中,抑制PARG可以通过调节与NF-κB有关通路,进一步调节ICAM-1、P-selectin等细胞粘附因子.提示PARG在肿瘤癌栓形成过程中可能具有重要作用.
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姜黄素对脑缺血大鼠SOD活性及Akt磷酸化水平的影响
目的 探讨姜黄素对脑缺血模型大鼠SOD酶活性及Akt磷酸化水平的影响.方法 48只SD大鼠随机均分为假手术组、手术模型组、姜黄素低、高剂量组.采用Zea Longa线栓法制作模型,检测各组大鼠的SOD活性和Akt磷酸化水平.结果 与假手术组比,模型组和姜黄素低、高剂量组SOD活性下降;与模型组比较,姜黄素低、高剂量组SOD活性升高(P＜0.05),但姜黄素低、高剂量组的SOD活性差异无显著性(P＞0.05);与假手术组比较,模型组的Akt磷酸化水平显著下降(P＜0.01),姜黄素低、高剂量组Akt磷酸化较模型组显著升高(P＜0.01),且高剂量组的Akt磷酸化水平较低剂量组高(P＜0.01).结论 姜黄素对脑缺血的保护作用可能与提高SOD活性及Akt磷酸化水平有关.
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GLP-1对大鼠胰岛氧化应激损伤的保护作用及机制研究
目的：观察GLP-1对H 2 O 2所致的胰岛β细胞氧化损伤的保护作用,探讨其抵抗氧化应激诱导的细胞凋亡作用机制。方法 Ficoll法分离纯化SD大鼠胰岛β细胞,实验分为正常对照组、H 2 O 2诱导胰岛损伤组、GLP-1预处理+H 2 O 2损伤组。采用FDA/PI染色法检测细胞存活,Annexin-V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测氧化应激和细胞凋亡相关基因iNOX、SOD2、Caspase-3、Bcl-2表达,Western blot检测胰岛细胞Akt、P-Akt、Caspase-3蛋白表达。观察GLP-1预处理能否减少ROS诱导的胰岛β细胞凋亡,以及在此过程中PI3K/Akt信号通路的改变。结果经 H 2 O 2损伤后胰岛β细胞的增殖活性、存活率和胰岛素分泌能力显著降低,细胞凋亡率显著升高；iNOS、Caspase-3基因表达显著升高,SOD、Bcl-2基因表达显著降低；Akt蛋白磷酸化水平明显降低, Caspase-3活性明显升高。 GLP-1预处理可显著提高β细胞的增殖活性、存活率和胰岛素分泌能力,减少细胞凋亡；显著降低iNOS、Caspase-3基因表达,上调SOD基因表达；增强Akt磷酸化,减少活化Caspase-3水平。结论 GLP-1对H 2 O 2所致的大鼠胰岛氧化应激损伤具有一定的保护作用,其作用机制与增强Akt磷酸化及抑制凋亡信号分子活化相关。
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SEMA3B对人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞Akt磷酸化调控作用的实验研究
目的:研究SEMA3B作为潜在的肺癌治疗药物诱导细胞凋亡作用的机制.方法:将pcDNA3.1/pcDNA3.1-SEMA3B质粒转染至Cos7细胞,400μg/ml G418筛选后建立稳定表达SEMA3B的Cos7细胞系.利用含有SEMA3B-Cos7细胞的培养上清液、特异性siRNA、实时定量PCR和蛋白免疫印迹方法,检测SEMA3B蛋白对Akt磷酸化及下游基因表达的影响及分子机制.结果:在细胞培养上清及细胞裂解液中稳定表达SEMA3B的Cos7细胞模型建立;利用含有SEMA3B蛋白的Cos7培养上清液及对照组培养上清液处理NCI-H1299细胞24小时后,含有SEMA3B蛋白组可显著降低H1299细胞内pAkt-ser473的蛋白表达及下游基因MDM2 mRNA表达,增加Caspase3 mRNA表达;特异性siRNA阻断IGFBP6表达,可部分消除SEMA3B抑制Akt磷酸化的作用,并影响其对MDM2和Caspase3的作用.结论:SEMA3B是通过IGFBP6介导其抑制Akt磷酸化作用及其下游基因表达,而发挥诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的作用,进一步提示在非小细胞肺癌中SEMA3B的抑癌作用及其潜在的治疗药物价值.
