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反基因操作技术及其在负链RNA病毒中的应用
反基因操作技术实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作,在深入阐明病毒基因组结构与功能、发展新型病毒载体、研制筛选基因工程疫苗及基因治疗等方面显示出良好的应用前景.本文对反基因操作技术及其在负链RNA病毒中的应用进行了综述.
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人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建
目的:构建人白细胞介素7(hIL-7)的真核表达载体.方法:从人脾脏组织的总RNA中,用RT-PCR方法扩增出编码成熟hIL-7的cDNA,将其克隆于pMD18-T质粒中,并进行序列测定.再将hIL-7cDNA以正义及反义插入真核、原核双重表达载体pBK-CMV质粒,转化至大肠杆菌DH5α.后将表达的lacz-hIL-7重组蛋白行SDS-PAGE电泳,并作考马斯亮蓝染色分析,western blot鉴定.结果:hIL-7序列测定结果与预期一致.pBK-CMV-hIL-7(正义插入)的克隆表达重组蛋白,western blot证实此蛋白为IL-7.结论:成功构建了hIL-7的真核表达载体,为进一步研究hIL-7的抗肿瘤作用创造了条件.
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Survivin在卵巢肿瘤的研究进展
Survivin 基因是近年来发现的凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的新成员,于1997年由Am-brosini等[1]用效应细胞蛋白酶受体-1的cDNA在人类基因组库中筛选克隆出来.
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RACE策略扩增EDAG-1基因3'端及序列分析
目的 通过RACE(rapid amplification of cDNA Ends)技术分析K-562细胞株中高表达的EDAG-1基因3'端.方法 采用Marathon-ReadyTM cDNA 方法扩增HLCM cDNA (人白血病细胞株K-562,Marathon-ReadyTM cDNA)的EDAG-1基因3'端,将扩增的特异带回收纯化,构建到原核表达载体中,提取质粒并且测序分析.结果 第1次扩增、第1次巢式PCR扩增未见明显特异带,2次巢式PCR结果可见200 bp特异带,回收后连接到pMD 18-T中,转化到大肠杆菌中并筛选阳性菌落,提取质粒测序,结果未发现该段序列存在点突变、插入或缺失.结论 EDAG-1基因在白血病细胞株K-562中高表达的机制可能与3'端无关.
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基于细胞培养的丙型肝炎病毒体外感染系统研究进展
近年来基于细胞培养的丙型肝炎病毒体外感染系统研究取得了突破性进展,促进人们对HCV生物学特性及其发病机制的全面认识,加速抗丙型肝炎药物及疫苗的研发步伐.本文就HCV发现以来的体外感染系统研究进展进行综述.
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人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达
目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因cDNA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hPTP1B)并在大肠杆菌中高效表达.方法 取2型糖尿病人(BMI＞28 kg·m-2)的淋巴细胞提取总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收构建克隆载体pMD-hPTP1B,测序后设计带酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE后用Western blot检测其特异表达,并进一步对rhPTP1B诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化.结果 测序证实所得的hPTP1BcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hPTP1B的双酶切结果与预期大小完全一致,IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式.IPTG诱导的佳浓度是0.05 mmol·L-1,时间为5 h,温度为37℃.结论 成功克隆了人PTP1B基因,构建了相应的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化,使其能在DE3中高效表达,为筛选高特异的小分子抑制剂和制备相应的单克隆抗体打下坚实的基础.
关键词： 蛋白酪氨酸磷酸酶1B cDNA pET-28a(+) 高效表达 包涵体 -
人颗粒溶解素cDNA克隆及在大肠埃希菌中的表达
目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA原核表达载体并进行表达.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得颗粒溶解素cDNA,克隆到pGEM-T载体,测序正确后,再亚克隆到质粒pGEX-4T1中,构建重组表达载体pGEX-4T1-granulysin,并转化大肠埃希菌DH5α,诱导GST-granulysin融合蛋白表达.结果:诱导含重组表达载体pGEX-4T1-granulysin的大肠埃希菌DH5α后,免疫印迹显示出一条相对分子量(Mr)为44 000的蛋白条带.结论:获得了颗粒溶解素与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础.
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亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其蛋白质结构与功能的生物信息学分析
目的 分析和预测亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其编码蛋白的结构与功能特性,用于指导其生物学功能的实验研究.方法 利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,如Vector NTI suite, 从亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中识别出泛素缀合酶基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构等.结果 该序列为全长基因,编码区为76bp-537bp,编码154个氨基酸.该序列为泛素缀合酶基因同源序列.其编码蛋白的理论分子量为17397.1,亚细胞定位在细胞核.预测该蛋白无跨膜区.与吸虫属的泛素缀合酶进化关系近.结论 应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲牛带绦虫泛素缀合酶cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面的信息.
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粉尘螨Ⅱ类抗原(Der f 2)的cDNA克隆测序及亚克隆
目的获得粉尘螨Der f 2 cDNA克隆及亚克隆,并进行测序.方法设计合成引物,从粉尘螨螨体中提取RNA,经RT-PCR获得cDNA,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至pMD-18T,转化大肠杆菌E.coli JM109,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序,将PCR筛检阳性重组子及pET-32a(+)表达载体分别用SacⅠ和NotⅠ双酶切,连接转化至E.coli Competent Cell JM 109中过夜培养,挑选菌落进行酶切鉴定.结果从粉尘螨基因组RNA中扩增出Der f 2 cDNA片段,成功构建pET-32a(+)-Der f 2亚克隆,酶切产物的大小与预期相符.结论成功地对粉尘螨Der f 2 cDNA进行体外扩增并构建pET-32a(+)-Der f 2亚克隆.
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亚洲带绦虫成虫谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及生物信息学分析
目的 分析亚洲带绦虫成虫谷胱甘肽S-转移酶(GST,glutathione S-transferase)基因结构并预测其编码蛋白的结构和功能.方法 利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,http://ca.expasy.org/)中生物信息学分析工具,并结合其它分析软件,从获得亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的表达序列标签(EST,expression sequence tag)中识别GST基因,分析该基因的结构并预测其编码的蛋白质的结构和功能特征.结果 该基因与猪带绦虫GST的一致性为94%,相似性为97%;全长810bp,编码区为28～687bp,编码219个氨基酸,无各种亚细胞定位序列,具有多个潜在的磷酸化位点,蛋白的理化性质稳定;预测三个主要的抗原表位89 aa～94 aa,27 aa～32 aa,119 aa ～124 aa 位于空间结构上相距较远的分子表面,前面两个表位属于绦虫共有的线性抗原表位.结论 从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出GST基因,预测为胞浆型蛋白,可能具有较好的免疫诊断抗原应用前景.
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日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位的分离和序列分析
目的分离和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonisum,Sj)新基因.方法应用表达序列标签(Expressed sequence tags,ESTs)法随机筛选Sj cDNA文库,通过PCR直接序列测定技术和同源性比较对阳性插入片段进行鉴定.采用亚克隆技术和生物信息学分析对日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录延长因子SⅢ-p15亚单位进行结构和功能的鉴定.结果我们从Sj cDNA文库中随机筛选到一个cDNA克隆,它含有一个371个碱基组成的阅读框,编码118个氨基酸,与哺乳动物等的RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位具有较高的同源性,且具有该因子所特有的氨基酸序列,表明我们已经获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位.结论获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位的全长cDNA序列,为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础.
关键词： 日本血吸虫 RNA聚合酶Ⅱ 转录延长因子SⅢ-p15 序列分析 cDNA -
猪囊尾蚴铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)基因的克隆和表达
目的 克隆猪囊尾蚴胞质含铜/锌的超氧化物歧化酶基因(Cu/ZnSOD),并比较其与其它寄生蠕虫相应基因结构的相似性.方法 通过获取其它生物Cu/ZnSOD基因的保守区域,设计保守引物,用于扩增该寄生虫的Cu/ZnSOD基因.结果 Cu/ZnSOD基因编码一15.6kDa的蛋白,该蛋白的推导序列中含有这类酶的活性和二级结构所需要的所有保守的氨基酸残基,并且与其它寄生虫的相应序列有高达70.6%的相似度.抑制剂研究试验表明所克隆的SOD属于Cu/ZnSOD,该蛋白在大肠杆菌中得以成功表达,表达产物具有SOD活性.免疫印迹试验发现猪囊尾蚴Cu/ZnSOD对人不仅具有抗原性,而且与其它几种蠕虫的Cu/ZnSOD有广泛的交叉免疫反应.结论 克隆并表达出猪囊尾蚴Cu/ZnSOD,它与其它寄生吸虫和绦虫的Cu/ZnSOD在氨基酸水平具有很高的相似度,因此是理想的广谱抗寄生虫药物和疫苗的靶蛋白,值得进一步研究.
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一种与人蛋白激酶CK2α'亚基相互作用蛋白的cDNA序列测定
目的:测定一种与人蛋白激酶CKα'亚基相互作用蛋白的cDNA序列.方法:选择一个与人蛋白激酶CK2α'亚基相互作用蛋白的重组质粒pGADT7-Library cDNA,使用BigDyeTM荧光标记终止底物循环测序试剂盒,用载体pGADT7的T7-启动子为测序引物,在ABI PRISM 310型基因分析仪上进行DNA测序.结果:该重组质粒的插入片段与泛素-核糖体蛋白S27a cDNA序列只有一个碱基的差别.结论:通过DNA测序,该种与人蛋白激酶CK2α'亚基相互作用蛋白为泛素-核糖体蛋白S27α的变体.
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PDX-1基因克隆载体的体外构建
目的：体外构建胰-十二指肠同源框-1( PDX-1)基因的克隆载体。方法采用TRIzol方法从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA,通过RT-PCR方法在体外扩增大鼠PDX-1 cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定,割胶纯化后回收目的基因,与pMD-18T克隆载体连接构建,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定pMD-18T-PDX-1的正确构建。结果正确构建了含有PDX-1 cDNA的克隆载体pMD-18T-PDX-1,其中PDX-1 cDNA全长为908 bp。将经双酶切鉴定正确的pMD-18T-PDX-1细菌克隆进行测序,测定结果与GenBank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致。结论成功构建了PDX-1基因克隆载体。该载体可为PDX-1基因分子生物学研究及PDX-1基因在诱导非β细胞向胰岛素分泌细胞分化中作用机制的研究提供基础。
关键词： 胰-十二指肠同源框-1 cDNA 胰岛细胞瘤 克隆载体 -
大鼠激素性股骨头坏死骨代谢差异表达基因的实验研究
目的:运用基因芯片技术,研究激素性股骨头坏死骨代谢相关基因的差异表达情况,进一步探讨其骨质疏松学说发病机理的分子机制.方法:wistar大鼠20只,随机分为对照组(n=10)和模型组(n=10),利用内毒素和甲强龙诱导激素性股骨头坏死模型,提取股骨头组织总RNA,采用基因芯片检测骨代谢关基因的表达改变.结果:基因芯片筛选出模型组与对照组大鼠与骨代谢相关的差异表达基因9条(Ratio>2.0).结论:在激素性股骨头坏死的过程中,骨代谢相关基因的表达受抑制,进而影响骨重塑和软骨代谢,导致骨质疏松.
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cDNA基因芯片技术在骨肉瘤研究中应用
骨肉瘤是严重危害儿童和青少年健康的一种骨原发性恶性肿瘤,研究骨肉瘤发生、发展、转移等相关基因,对其发病的分子生物学机制、早期诊疗和预后评估等方面有重要价值.cDNA基因芯片技术作为一种可平行、快速、敏感、高效检测正常组织与肿瘤组织基因差异的技术,现已广泛应用到骨肉瘤的研究中,本文就其在骨肉瘤研究中应用进展作一综述.
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人肝细胞癌差异表达基因TCTP的克隆和分析
目的筛选和鉴定在人肝细胞癌中差异表达的基因.方法采用抑制性消减杂交技术建立人肝细胞癌cDNA消减文库,通过DNA测序分析、Northern印迹、cDNA末端快速扩增和RT-PCR等方法对其中一个克隆基因加以分析.结果从所建cDNA消减文库中分离到一个插入子长度为479bp的克隆,该片段含有3'端Poly(A)结构,Northern杂交证明其表达水平在癌组织和肝癌细胞株均显著升高,同时经5'末端快速扩增获得一个长度为865bp的全长cDNA序列,具有一个编码172个氨基酸的完整开放阅读框,与GenBank数据库作同源性分析显示其为已报道的TCTP基因.RT-PCR分析表明TCTP基因在癌组织样本中的扩增水平高于癌旁非癌组织样本.结论TCTP基因的差异表达可能在肝癌发生机制中扮演重要角色.
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ox-LDL特异性人血管平滑肌细胞cDNA消减文库的构建
目的:构建ox-LDL特异性人血管平滑肌细胞cDNA消减文库.方法:35%ug/ml ox-LDL刺激培养的人血管平滑肌细胞,利用消减杂交技术,构建cDNA消减文库,并运用蓝白斑筛选和影印杂交进一步确定文库克隆的特异性.结果:成功构建ox-LDL特异性血管平滑肌细胞cDNA消减文库,约2000个白色克隆.影印杂交后共获82个差异表达克隆.结论:消减文库的构建为进一步克隆ox-LDL特异性基因cDNA片段和全长奠定了基础.
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杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析
目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对.结果:克隆获得531 bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBank AN:AY965896).同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%.结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.
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杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白cDNA片段的克隆及序列分析
目的:克隆杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白片段.方法:根据多种生物MAR结合蛋白氨基酸的高度保守序列EWYGWHF和KYGLIYQ,设计一对简并引物,以杜氏盐藻的cDNA为模板,进行PCR扩增,PCR产物与T载体相连,转化大肠杆菌JM109后,筛选鉴定,对阳性菌落进行测序分析.将测序结果推导成氨基酸序列,与GenBank上其他物种MAR结合蛋白序列进行同源性分析.结果:在杜氏盐藻中得到的cDNA片段,核苷酸长度为474 bp,编码158个氨基酸(GenBank收录号为DQ124215).推导的氨基酸序列与稻、莲、拟南芥、豌豆、烟草、酵母、果蝇和蟾的MAR结合蛋白相比较,同源性分别为74%、73%、73%、73%、71%、70%、68%和67%.结论:所克隆的序列可能为杜氏盐藻MAR结合蛋白片段.
关键词： 杜氏盐藻 核基质附着区结合蛋白 cDNA 简并引物
