首页 > 文献资料
-
EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建
目的克隆EBV-LMP1 cDNA,构建EBV-LMP1基因的原核表达重组质粒.方法通过RT-PCR技术从B95-8细胞中扩增EBV-LMP1 cDNA,克隆至pGEM-T easy载体上并测序;利用引物上的BamHⅠ与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a,转化JM109菌.提取质粒,限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定.结果扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp,测序结果与已知序列吻合,重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子.结论成功克隆了EBV-LMP1 cDNA,并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体,为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础.
-
鼻咽癌组织差异表达cDNA序列的克隆与鉴定
目的：分析鼻咽癌组织中的差异基因，寻找与鼻咽癌病理过程相关的新的癌基因和抑癌基因。方法：应用抑制性消减杂交法，构建了鼻咽组织与正常鼻咽组织的消减库；用差异筛选技术筛选出了阳性克隆；用Southern blot和Northern blot杂交证实了阳性克隆的可靠性；用序列分析确定了阳性克隆的性质。结果：从消减库中获得了12个阳性克隆；序列分析表明,8个克隆与已知基因高度同源，2个为新的候选基因,2个新的候选基因在两个不同的消减库中确实存在差异，而其中的一个新基因在鼻咽癌组织和细胞系中下调表达。结论：抑制性消减杂交是分析相关基因的较好的方法,发现了两个与鼻咽癌病理过程有关的新的cDNA。
-
不同分化程度的胶质瘤细胞侵袭相关差异表达基因的筛选
目的 用基因芯片技术分析不同分化程度的胶质瘤细胞侵袭相关的差异表达基因,为进一步研究胶质瘤的侵袭机制提供依据.方法 以Trizol试剂盒提取总RNA,用SuperscriptⅡ反转录酶进行反转录聚合酶链反应,并以荧光染料Cy3和Cy5分别标记胶质瘤细胞系SHG-44(WHO Ⅳ级)和CHG-5(WHOⅡ级)的cDNA产物,然后进行芯片杂交,检测CHG-5和SHG-44细胞的基因表达谱,鉴定差异表达基因;随机选择数个差异基因进行Northem杂交实验.以验证cDNA微阵列结果的可靠性.结果 与SHG-44相比,CHG-5细胞有102个基因表达上调、90个基因表达下调,这些差异表达基因按功能分为:凋亡类、细胞迁移和转移类、细胞周期与生长调节类、细胞骨架类、分化类、细胞代谢类、癌基因、氧化磷酸化类、受体与信号传导类、核蛋白体类、泛素-蛋白酶系统类、生长因子与细胞因子类及其他等.其中与侵袭相关的差异表达基因共13个(上调基因有6个、下调基因7个),芯片结果进一步得到Northern blot杂交结果的支持.结论 初步揭示不同级别的胶质瘤细胞系之间存在侵袭相关基因的差异表达,提示这些差异基因可能与胶质瘤的进展有关.
-
人脑胶质瘤组织全长cDNA文库的快速构建与鉴定
目的采用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技术,快速构建高质量的人脑胶质瘤组织全长cDNA文库.方法提取多份人脑胶质瘤组织标本的总RNA,混合后处理得到纯化的mRNA,利用CDSⅢ/3'PCR引物(含SfiⅠB酶切位点)反转录,用SMARTⅣOligo(dT)(含SfiⅠA酶切位点)作为mRNA5'端延伸出去的模板,合成多出一段SMARTⅣOligo(dT)互补序列的cDNA第一链,进而以此序列为引物合成全长的双链cDNA.双链cDNA经SliⅠ(A＆B)酶切后克隆入经SfiⅠ酶切的λTriplEx2载体,再经噬菌体包装蛋白包装成为cDNA文库.结果获得2.4×106个重组子,重组率达100%,文库扩增后,滴度达4.5×109pfu/ml,插入cDNA平均长度为1.2kb.结论成功构建高质量的人脑胶质瘤组织全长cDNA文库,为进一步筛选、克隆人脑胶质瘤抑癌基因及特异性表达基因奠定基础.
-
人干细胞因子（SCF）5’旁侧调控序列与其全长cDNA融合克隆的构建及鉴定
目的：为研究人干细胞因子（SCF）5’旁侧1.42 kb区域内不同序列对全长cDNA在真核细胞中表达的调控作用，构建了SCF5’旁侧1．42 kb的调控序列与其1．2 kb的全长cDNA融合克隆。方法：将PCR获得的SCF5’旁侧1．42 kb的调控序列与RT-PCR获得的其1．2 kb的全长cDNA克隆入pGEM-T载体，筛选正确插入方向，利用合适的限制性内切酶从中切出三个片段依次亚克隆入pUC19克隆载体中。结果：获得了SCF5’旁侧 1．42 kb的调控序列与其1．2 kb的全长cDNA并成功地构建了它们的融合克隆。结论：T-载体在克隆添加了少量具有3’→5’外切核酸酶的PCR产物中仍然有效；在稍大片段的基因克隆操作中，利用分段亚克隆的方法，避开干扰另外的酶切位点，依次分段亚克隆更为可行。
-
人骨质疏松cDNA表达文库的构建及分析
目的构建人骨质疏松骨组织cDNA文库,为筛选与骨质疏松的发生特异相关的基因及探讨骨质疏松发病机制奠定基础.方法以Trizol一步法从骨质疏松小鼠长骨中提取总RNA,分离纯化mRNA,LD-PCR法反转录合成双链cDNA,以λTripEX2为载体,构建骨质疏松小鼠cDNA文库,对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定.结果原始文库的滴度为4.8×105pfu/ml,总克隆数为4.6×105,重组率为96.2%,扩增后文库总滴度为6.1×109pfu/ml,插入片段多分布在0.5～2.6kb之间,绝大部分在1.4～1.9kb左右,文库质量鉴定结果表明,构建的骨质疏松小鼠cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.结论构建cDNA文库为克隆骨质疏松相关功能基因的研究奠定了基础.
-
一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析
目的:克隆出五步蛇的类凝血酶cDNA,为研究其结构和功能的关系,并为下一步基因表达开发抗血栓药物提供依据和基础.方法:从五步蛇蛇腺中提取了总RNA,通过反转录合成第一链cDNA,经PCR 扩增出五步蛇毒腺中类凝血酶TLE1的cDNA片段,并将其连接到质粒载体扩增,然后进行DNA测序.结果:成功克隆出一种新的五步蛇类凝血酶的cDNA片段.此片段全长794bp,包括编码部分的全长为777bp.推导其编码的蛋白质序列为258个氨基酸,其中包括18个氨基酸的信号肽,6个氨基酸的前肽和234个氨基酸的成熟氨基酸顺序.TLE1成熟肽与其它蛇毒类凝血酶相比,蛋白质一级结构具有较高的同源性.结论:从五步蛇中成功克隆出一种新的类凝血酶cDNA,并确定了它的DNA顺序.
-
利用5'-RACE技术进行人肝再生增强因子相互作用肽cDNA5'末端快速扩增及序列分析
目的:利用5'-RACE技术进行人肝再生增强因子(hALR)相互作用肽cDNA5'末端快速扩增并进行序列分析.方法:按照5'-RACE试剂盒(Takara)操作流程进行hALR相互作用肽cDNA5'末端快速扩增,用BLAST技术对扩增序列进行生物信息学分析.结果:成功获取487bp的5'-RACE反应产物,其中5'端延伸了275bp,同源序列分析表明与人Citron激酶mRNA高度同源.结论:5'-RACE技术可以用于快速有效扩增已知部分cDNA序列的5'末端,Citron激酶可能是与hALR具有相互作用的蛋白.
-
利用噬菌体表面展示技术构建人肝癌细胞的cDNA表达文库
目的:筛选对人肝再生增强因子(hALR)高反应性的肝癌细胞株,以此作为细胞来源,利用噬菌体展示技术构建出含有其cDNA表达文库,为进一步从文库中筛选hALR相互作用蛋白奠定基础.方法:hALR刺激不同肝癌细胞株,从中筛选出对hALR刺激有高反应性的细胞株.以Poly ATtract System1000提取mRNA,用T7Select10-3 Orient Express cDNA CloningSystem和Random Primer构建它的cDNA噬菌体表面展示文库;以噬菌体滴度分析和PCR评价文库质量.结果:hALR对不同肝癌细胞株均有不同程度的促增殖作用,且呈明显的剂量依赖关系.对QGY促增殖作用强,以它作为建库细胞.对所建文库进行噬菌体滴度分析,表明原始cDNA文库含有2×107独立的重组子;随机挑取重组子进行PCR鉴定,发现插入长度在0.2～2kb,平均为0.6kb,能够较好地代表来源细胞中mRNA所表达的几乎所有信息.结论:hALR对所检测的肝癌细胞株均有促增殖作用;QGY细胞对hALR刺激有高的反应性;以它为基础,构建出库容量为2×107的高质量噬菌体表面展示文库.
-
苦参碱诱导 K562 细胞分化相关 cDNA 的克隆
目的克隆苦参碱诱导人白血病K562细胞分化的相关基因,以求了解白血病细胞分化及苦参碱的作用机制.方法以人白血病细胞K562为研究对象,在苦参碱诱导其分化的基础上,利用mRNA差异显示技术对K562细胞在苦参碱诱导前及诱导后48小时的基因表达情况进行分析.结果在苦参碱诱导前后的K562细胞之间存在明显的基因表达差异,一些基因在诱导后表达增强,而一些基因经苦参碱作用后表达减弱甚至完全抑制.经克隆和筛选获得部分表达差异的cDNA片段,为进一步研究苦参碱的诱导分化机制及肿瘤细胞发生和分化机制打下了基础.结论苦参碱具有调控分化相关基因表达的作用,苦参碱诱导K562细胞分化是多基因共同参与的过程.
-
大鼠微管相关蛋白4重组腺病毒载体的构建及在细胞中的表达鉴定
目的构建大鼠微管相关蛋白4(microtubule-ossociated protein 4,MAP4)重组腺病毒载体,并转染新生大鼠体外培养的心肌细胞进行表达和鉴定,为真核表达及有关实验研究提供基础.方法设计1对引物,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从大鼠心肌细胞总mRNA中扩增出MAP4 cDNA,并将MAP4 cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle2中,构建pShuttle2-MAP4表达质粒.将此表达质粒扩增纯化酶切获得含有目的片段MAP4 cDNA的表达盒与Adeno-X Virul DNA重组并线性化后转染HEK293T细胞,包装产生大鼠MAP4重组腺病毒.并且转染新生大鼠原代心肌细胞,应用免疫组化的方法进行表达鉴定.结果扩增所得的MAP4 cDNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序终确定为大鼠MAP4基因,所得大鼠MAP4重组腺病毒滴度为2.3×108pfu/ml.转染原代心肌细胞48 h后MAP4表达显著增强.结论为研究MAP4的生物学活性及功能的基因治疗提供了基础.
-
人PPARγ2 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化
目的克隆中国人的PPARγ2 cDNA,并在大肠杆菌中进行表达纯化.方法从正常人面部脂肪组织分离总RNA,采用RT-PCR及序列测定等方法获得人的PPARγ2 cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达;在N末端融合了6×His纯化标签的表达产物进行Western blot分析和用Ni2+-NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析.结果获得了正常中国人的PPARγ2 cDNA,并成功构建了高效原核表达质粒pET28a-PPARγ2;Western blot结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量为56×103的PPARγ2目的蛋白;表达产物经Ni2+-NTA离子交换树脂纯化,PPARγ2蛋白的纯度大于90%以上.结论克隆得到正常中国人PPARγ2 cDNA的序列与Genebank报道的序列一致,并且在E.coli中成功表达和纯化了PPARγ2蛋白.此研究为后续PPARγ2功能活性和配体的筛选实验奠定了基础.
-
斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析
目的克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,获得其序列,并进行序列分析.方法利用简并引物,进行RT-PCR,扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段.TA克隆装入pUCm-T载体,进行鉴定、测序;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析.结果 RT-PCR扩增出了一500 bp左右的cDNA片段,对阳性克隆测序后获得其核酸序列,长498 bp.推导出的氨基酸序列长166;氨基酸序列的同源性分析显示,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守.结论本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段.
-
斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析
目的克隆斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法利用简并引物,进行RT-PCR,扩增斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段.TA克隆装入pUCm-T载体,进行鉴定、测序;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析.结果 RT-PCR扩增出了一约500 bp的cDNA片段,对阳性克隆测序后获得其核酸序列,长495 bp.将推导的氨基酸序列作同源性分析显示,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着较高的同源性,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守.结论克隆获得了斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点.
-
人白细胞介素10重组腺病毒载体的构建
目的构建人白细胞介素10重组腺病毒载体,为真核表达及其临床研究提供实验基础.方法自行设计一对引物,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10cDNA,并将hIL-10cDNA克隆到腺病毒载体pAdCMV-Link1中,构建pAdCMV/hIL-10表达质粒.将此表达质粒与腺病毒重组质粒pJM17共转染293细胞,通过同源重组产生hIL-10重组腺病毒.结果扩增到的cDNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序终确定为hIL-10cDNA;所得人白细胞介素10重组腺病毒滴度为1.9×109 pfu/mL.结论本实验为今后研究hIL-10的生物学活性及炎症性疾病的基因治疗提供了基础.
-
用反向遗传技术产生冷适应致弱的重组A型人流感病毒的研究
目的 以鸡胚高度适应株A/PR/8/34株为重组流感病毒骨架,利用反向遗传技术拯救冷适应致弱的重组A型人流感病毒.方法 对冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60(H2N2)流感病毒株的PB2基因片段,进行了全基因序列合成,同时人工引入PB2265(N265S)氨基酸的突变.PB2基因片段通过与改造后的转录/表达载体pAD3000连接,构建PB2基因的拯救载体.该重组质粒与PR8进行"7+1"组合的病毒拯救,共转染COS-1细胞.结果 经测序获得序列准确的拯救质粒pMDV-A-PB2,利用反向遗传技术成功拯救出了具有血凝性(1×25)的冷适应的重组A型流感病毒.结论 利用反向遗传技术成功拯救冷适应致弱的重组A型人流感病毒,该系统为深入研究甲型人流感病毒的基因功能和新型疫苗研发奠定了基础.
-
粉尘螨Ⅰ类抗原cDNA的克隆表达和初步鉴定
目的构建粉尘螨Ⅰ类抗原(Der f1 )cDNA基因的重组表达质粒,并于E.coli表达.方法用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD-18T-Der f1上切下Der f1基因,插入表达载体pET32a(+)质粒,转化大肠杆菌BL21,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定.重组质粒pET32a(+)-Der f1转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和薄层凝胶扫描定量分析.结果对重组质粒进行酶切和PCR鉴定,与预期结果相符,证明已成功构建携带Der f1基因的重组原核表达质粒pET32a(+)-Der f1.核酸序列测定及同源性分析证实所构建的原核表达质粒pET32a(+)-Der f1中所含的Der f1基因与GenBank中的Der f1序列同源性达到99.5%.Der f1基因在大肠杆菌诱导表达后获得Mr约45 000的蛋白,蛋白含量占全菌体蛋白含量的15%.结论成功构建了粉尘螨Ⅰ类抗原cDNA基因的重组表达质粒pET32a(+)-Der f1,并在大肠杆菌中获得高效表达,为获得重组纯化Der f1变应原并用于尘螨变应性疾病的诊治奠定基础.
-
中国南方汉族人群KIR2DS4基因的多态性
目的 探讨南方汉族人群KIR2DS4分子遗传多态性.方法 应用特异性PCR引物扩增306名无关个体KIR2DS4基因的全部外显子,确定KIR2DS4框架基因的有无.对存在KIR2DS4的样本,对该基因的全部外显子进行双向测序,用Assign 3.5分析软件鉴定基因型.在测序分型中出现与国际IPD-KIR数据库不完全匹配结果的样本,进行cDNA分子克隆和单倍型测序.结果 306名南方汉族无关个体中,携带KIR2DS4基因的个体为297例,经测序分型,均获得了清晰的序列峰图.共检出了7种等位基因,其中3个新等位基因被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名.检出的等位基因及其频率分别为KIR2DS4* 00101(78.8％)、*003 (10.5％)、*004 (16.0％)、*010 (23.2％)、*017(0.3％)、* 00105(0.3％)和*018(0.7％),未检出KIR2DS4* 007等位基因.能正常表达于细胞表面的等位基因(KIR2DS4* 00101、*017、*00105)和不能正常表达于细胞表面的等位基因(KIR2DS4* 003、*004、*010、*018)的检出比例分别为79.4％及50.4％,约为1.6∶1.结论 获得了南方汉族人群KIR2DS4等位基因分子遗传多态性,可为移植、疾病关联研究及人类进化等提供基础数据.
关键词： KIR2DS4 框架基因 测序分型 cDNA 分子克隆 新等位基因 -
KIR2DL1框架基因cDNA的分子克隆测序及一个新等位基因的鉴定
目的：建立KIR2DL1框架基因 cDNA 的分子克隆测序方法,并鉴定南方汉族人群一个新的KIR2DL1等位基因。方法对一KIR2DL1框架基因测序分型结果异常的外周血样,提取 mRNA,反转录为 cDNA,用1对KIR2DL1框架基因特异性 PCR 引物进行扩增,特异性扩增产物(1.2 kb)经切胶回收纯化后,进行分子克隆和单倍型测序。结果KIR2DL1特异性 PCR 扩增产物,经分子克隆和单倍型测序,检出1个正常的KIR2DL1?00302等位基因和1个新变异的KIR2DL1等位基因。该新等位基因的序列与KIR2DL1?00302相近,但存在编码区 nt 188 A>G 点突变、位于第4外显子的第42密码子由 GAG 变成 GGG,导致第42位氨基酸残基发生 Glu42Gly 改变；其序列提交 GenBank(序列号：KP025960)和 IPD-KIR 数据库(IWS40001982),已被世界卫生组织 HLA 因子命名委员会 KIR 分委会正式命名为KIR2DL1?031。结论我们建立了KIR2DL1框架基因 cDNA 分子克隆测序方法,在等位基因水平的 KIR 研究中具有广泛的应用前景。
-
南方汉族人群KIR2DL4基因的多态性及五个新等位基因的鉴定
目的 研究南方汉族人群KIR2DL4基因的遗传多态性.方法 采用自行设计的PCR引物对306名南方汉族无关个体KIR2DL4框架基因的8个外显子进行扩增,之后进行双向测序,用Assign 3.5软件分析各样本的等位基因型.对与国际IPD-KIR数据库不完全匹配的样本进行cDNA分子克隆和单倍型测序.结果 共检出11种KIR2DL4等位基因,其中KIR2DL4*00503、*00504、*032、*033、*034被WHO HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为新等位基因.检出的等位基因及其频率分别为KIR2DL4*00102(75.5％)、*00103 (8.2％)、*00501 (34.0％)、*00503 (0.7％)、*00504 (0.7％)、* 00602(14.4％)、*00801(11.4％)、*011(22.2％)、*032(0.3％)、*033(0.3％)和*034(0.3％).第7外显子CDS nt811位置正常的10A型等位基因(KIR2DL4*00102、*00103、*00501、*00503、*00504、* 00602、*032、*033、*034)和CDS nt811位置缺失腺嘌呤的9A型等位基因(KIR2DL4*00801、*011)的检出比例分别为97.0％及33.0％,约为2.9∶1.结论 获得了南方汉族人群KIR2DL4等位基因分子遗传多态性的基础数据,可为移植、生殖免疫、疾病关联研究及人类进化等提供参考.
关键词： KIR2DL4框架基因 测序分型 新等位基因 cDNA 分子克隆
