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双顺反子载体pWISG的构建和共表达
肿瘤放、化疗对骨髓的抑制作用限制了其使用剂量,如何保护骨髓中的造血干细胞免受放化疗引起的杀伤和凋亡是研究热点之一.已知WEE1Hu可使细胞生长停滞于G2期检测点,以确保细胞在进入有丝分裂前完成DNA的复制和损伤修复[1],并且WEE1Hu可以抑制HIV、γ射线等诱导的细胞凋亡.人干细胞因子(hSCF)是一种重要的造血细胞生长因子,主要调控造血祖细胞的增殖、分化[2],并有一定的抗损伤作用.本实验采用核糖体插入位点(IRES)构建WEE1Hu、SCF/GFP双顺反子重组表达质粒pWISG,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来研究两者的共表达,为进一步功能研究奠定基础.
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干细胞因子的研究及其应用
人干细胞因子(hSCF)是新近发现的重要造血细胞因子,它是酪氨酸激酶受体c-Kit的配体.SCF主要作用于早期造血干细胞、原始造血祖细胞,并且诱导这些细胞的存活、增殖和分化.SCF单独使用生物学作用低,但它与其它细胞因子具有强的协同作用.在临床Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期研究中,SCF和G-CSF联合应用,与单独使用G-CSF比较,CD34+细胞数增加2～3倍.安进公司采用基因重组技术在大肠杆菌中生产的重组人SCF(r-met hSCF)商品名为STEMGENTM.SCF临床使用,包括体内干细胞扩增治疗(ex vivo)和用于基因治疗的体外培养造血干细胞.SCF与G-CSF联合使用刺激扩增外周血干/祖细胞(PBPC),可用于干/祖细胞移植,以增加患者所需PBPC的比例,减少收集PBPC的次数.本综述主要介绍了人SCF的功能,临床研究和其它潜在应用.
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人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物结构分析及活性研究
目的确证人干细胞因子基因在大肠杆菌表达产物的正确性.方法通过蛋白质杂交,氨基酸末端序列分析,质谱分析及动物体内生物活性的研究,对人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物--重组人干细胞因子(rhSCF)分子进行了鉴定.结果大肠杆菌表达产物rhSCF N端15个氨基酸序列及C端2个氨基酸序列与理论推测一致,产物的相时分子质量为18 583.75,质量肽谱与理论序列的重叠率为98.2%,动物试验亦表明当与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)联用具有显著的外周血干(祖)细胞动员作用.结论人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物与理论推测完全一致,为其中试及临床试验奠定了基础.
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噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽
目的 用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽.方法 采用酶联免疫吸附测定法(EUSA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性.结果 经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列.序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列.MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显.结论 获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽.
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人干细胞因子（SCF）5’旁侧调控序列与其全长cDNA融合克隆的构建及鉴定
目的：为研究人干细胞因子（SCF）5’旁侧1.42 kb区域内不同序列对全长cDNA在真核细胞中表达的调控作用，构建了SCF5’旁侧1．42 kb的调控序列与其1．2 kb的全长cDNA融合克隆。方法：将PCR获得的SCF5’旁侧1．42 kb的调控序列与RT-PCR获得的其1．2 kb的全长cDNA克隆入pGEM-T载体，筛选正确插入方向，利用合适的限制性内切酶从中切出三个片段依次亚克隆入pUC19克隆载体中。结果：获得了SCF5’旁侧 1．42 kb的调控序列与其1．2 kb的全长cDNA并成功地构建了它们的融合克隆。结论：T-载体在克隆添加了少量具有3’→5’外切核酸酶的PCR产物中仍然有效；在稍大片段的基因克隆操作中，利用分段亚克隆的方法，避开干扰另外的酶切位点，依次分段亚克隆更为可行。
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干细胞因子研究进展
人干细胞因子(hSCF)是新近发现的重要造血细胞因子,它是酪氨酸激酶受体c-Kit的配体.SCF主要作用于早期造血干细胞、原始造血祖细胞,并且诱导这些细胞的存活、增殖和分化.SCF单独使用生物学作用低,但它与其它细胞因子具有强的协同作用.SCF临床应用,包括体内干细胞扩增治疗、用于基因治疗的体外培养造血干细胞及肿瘤放疗化疗后的辅助治疗.SCF与G-CSF联合使用刺激扩增外周血干/祖细胞(PBPCs),可用于干/祖细胞移植,以增加患者所需PBPCs的比例,减少收集PBPCs的次数.本综述主要介绍了人SCF的发现、结构、功能及临床应用.
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可溶型人干细胞因子cDNA的克隆表达、复性与纯化
目的:构建可溶型人干细胞因子(hSCF)基因的表达载体.优化培养条件,实现hSCF基因在大肠杆菌中的高表达.方法:利用PCR技术,以人淋巴结cDNA为模板扩增并克隆hSCF基因.用简并PCR对hSCF基因5′端的序列进行修饰,以实现在大肠杆菌中的高效表达;用MTY比色法测定初步复性和纯化的hSCF蛋白的生物学活性.结果:扩增并克隆了hSCF成熟肽cDNA.将其插入表达载体pBV220构建了hSCF基因的表达质粒,并在大肠菌中初步表达.表达量占总菌体的20%以上,优化培养条件后表达量可达到40%以上,表达产物为包涵体.将包涵体溶解在8 mol/L脲或7 mol/L盐酸胍中,用疏水色谱法进行复性并同时纯化,得到具有天然生物学活性的rhSCF蛋白.结论:成功地克隆hSCF基因,并实现在原核系统中的高表达,所获表达菌株可用于生产以获得具有生物学活性的rhSCF蛋白产品.
