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白细胞介素18在人白血病细胞系J6-1的表达及其意义
目的阐明白细胞介素18(IL-18)在人白血病细胞系J6-1的表达与调控,探讨IL-18 在白血病发生中的意义.方法应用逆转录浆合酶链反应检测IL-18 mRNA的表达,酶切鉴定其特异性;构建IL-18的重组质粒,测序分析其cDNA 序列的同源性;应用反义核酸技术,观察不同浓度的IL-18反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对J6-1细胞增殖的影响. 结果 J6-1细胞组成性高表达IL-18 mRNA,测序结果表明,其cDNA 序列与文献报道IL-18的同源性为99%, 仅有一处同义点突变(35 UCA→UCC).正常人外周血单个核细胞(PBMC)IL-18 mRNA的表达水平很低(0.13±0.05),CpG寡脱氧核苷酸(CpG - ODN)显著上调IL-18在PBMC的表达(0.82±0.24),但对J6-1细胞无类似上调作用.IL-18在J6-1细胞的表达水平(0.98±0.29)明显高于在K562、HL-60、U937和LCL细胞系的表达.IL-18 ASODN能显著抑制J6-1细胞的增殖(抑制率43.3%),而对HL-60的抑制作用不明显(抑制率16.7%). 结论 J6-1细胞组成性高表达IL-18;IL-18基因的编码区在J6-1细胞不存在有意义的突变;IL-18可能通过自分泌途径正向调节J6-1细胞的增殖.
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脑胶质瘤相关新基因PKIβ的表达与蛋白质性质的研究
目的 运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因,并对其中1条基因进行了克隆和表达.方法 抽提正常成人脑组织与脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机观察二者表达谱的差异情况,对436F11克隆子进行Northern印迹,生物信息学分析和蛋白质的表达.结果 通过4次基因芯片筛选,获得15条与胶质瘤相关的新基因,经Northern印迹证实436F11基因在人正常脑组织中高表达,而在人脑胶质瘤中低表达.BLASTn和BLASTx分析显示,436F11基因为全长新基因,共编码78个氨基酸,其理论相对分子质量为8468等电点为4.69,与鼠PKIβ69%同源,命名为人PKIβ.并在大肠杆菌中得到了PKIβ较高的表达蛋白,经纯化,在SDS-PAGE胶上获得了1条清晰的条带.氨基酸测序和分子量测定与生物信息学结果完全一致.结论 基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少,高质量,高速度,高敏感等特性.人PKIβ可能是与人脑胶质瘤形成有关的1条全长新基因,这为脑胶质瘤的基因治疗提供了一条新思路.
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以cDNA为内参标RT-PCR定量检测心肌细胞内p53和Bcl-2基因mRNA表达量的方法研究
目的:探讨p53和Bcl2基因在急性心肌梗死时心肌细胞中mRNA表达量的检测方法.方法:用以cDNA为内参标的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测p53和Bcl-2基因的mRNA表达量.结果:p53基因mRNA表达量[mRNA/总RNA(ng/g)]依次为:冠脉结扎后4小时组(57 648.78±19 776.96) ng/g>结扎后6小时组(339.06±104.11) ng/g>结扎后3小时组(165.44±33.36) ng/g>结扎后2小时组(88.25±16.65) ng/g>未结扎(0)组(3.16±0.69) ng/g和结扎后1小时组(16.37±2.73) ng/g、8小时组(23.13±7.03) ng/g、12小时组(6.75±2.86) ng/g,P均<0.05;Bcl2基因mRNA表达量[mRNA/g总RNA(ng/g)]:冠脉结扎后3小时组(4.53±1.59) ng/g、4小时组(0.02±0.01) ng/g和6小时组(3.46±0.39) ng/g<结扎后2小时组(52.48±14.18) ng/g、8小时组(59.24±2.91) ng/g<结扎后1小时组(77.20±12.48) ng/g和未结扎(0小时)组(81.77±9.62) ng/g<结扎后12小时组(99.60±4.71) ng/g,P均<0.05.该种方法能对不同的样本检出不同量的mRNA含量,其特异性强,且能检出0.02 ng/g的mRNA含量,敏感性高.结论:以cDNA为内参标的RT-PCR定量检测心肌细胞内p53和Bcl-2基因mRNA表达量的方法,其特异性强、敏感性高;在普通的分子生物学实验室完成,方法简便,且价钱便宜,可推广使用.
关键词： 心肌 P53 Bcl-2 逆转录-聚合酶链反应 cDNA -
应用全自动DNA测序仪测定人胰岛素cDNA碱基序列
糖尿病病因复杂,虽经多年不懈努力,但糖尿病的诊疗仍是一大难题.近年来,应用分子生物学技术,解决了很多疾病的诊治难题.
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猪带绦虫腺苷酸激酶基因及蛋白结构特性分析
目的 分析和预测猪带绦虫腺苷酸激酶(ADK)基因及其编码的蛋白结构和特性.方法 利用各种在线生物信息网站及其它分析软件包,分析从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中识别的腺苷酸激酶基因的结构和编码区序列,分析、预测编码的蛋白质的理化特性、抗原表位、翻译后的修饰、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等.结果 该基因全长864 bp,编码区为110～758,编码215个氨基酸,为全长基因.理论分子量、等电点分别为23771.4 Da和6.86;没有跨膜区;三维结构建模图显示其线性表位的部位.结论 应用生物信息方法 从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了腺苷酸激酶基因的cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面的信息.
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亚洲带绦虫膜联蛋白B3基因生物信息学分析
目的 识别亚洲带绦虫新基因,分析和预测该基因及其编码蛋白的结构和特性,为其生物学功能研究提供依据.方法 利用在线生物信息学网站及工具进行序列分析、预测其编码的膜联蛋白B3的理化特性、抗原表位、翻译后的修饰、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象、进化树等.结果 该基因全长1176 bp,编码区为70～588 bp,编码173个氨基酸,为全长基因;无跨膜区;具有多个磷酸化位点和B细胞线性表位;蛋白的理化性质稳定,理论分子量为19339.7;没有质体、线粒体定位序列;氨基酸序列高度保守.结论 运用生物信息学方法 从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中识别出了亚洲牛带绦虫成虫膜联蛋白B3基因,并对其所编码的蛋白质的结构与功能进行预测.
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人神经生长因子cDNA的体外扩增
目的提取人胎盘组织中RNA,以其中的mRNA为模板,扩增人βNGFcDNA,并测定核苷酸序列,为进一步克隆及表达βNGFcDNA奠定基础.方法采用异硫氢酸胍法提取RNA;采用RT-PCR技术扩增人βNGFcDNA;Sanger双脱氧链终止法测定核苷酸序列.结果从人胎盘组织中提取RNA,以其中的mRNA为模板,扩增出人βNGFcDNA,经琼脂糖凝胶电泳鉴定为目的片段,序列测定证实与实际序列相符.结论以人胎盘组织中的mRNA为模板,运用RT-PCR技术扩增βNGFcDNA,扩增时在5＇端以限制性内切酶酶切位点加以修饰,以便于βNGF基因的克隆及表达.
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黑胸胡蜂毒素基因蛋白磷脂酶A1的克隆和减毒抗原设计
通过胡蜂毒腺组织的全转录组测序技术,构建黑胸胡蜂毒腺组织cDNA的序列信息库.根据毒素蛋白质研究提供的一小段蛋白质序列,将本地Blast技术和分子克隆技术结合在一起,克隆得到黑胸胡蜂毒液蛋白磷脂酶A1的基因序列,命名为VT-1;并采用生物信息学方法,预测VT-1的蛋白质序列和三级结构.序列分析显示,VT-1蛋白质与已发现的磷脂酶A1蛋白同源,属于磷脂酶A1家族成员;结合VT-1和其它已经报道的磷脂酶A1序列,采用空间结构预测和序列比对方法发现,磷脂酶VT-1盖结构域中含有保守谷氨酸(E),在Ca2+存在下,可能增强VT-1的磷脂酶活性,提高毒性.根据磷脂酶VT-1盖结构域中谷氨酸(E)保守性,设计两个VT-1的减毒抗原.为靶向黑胸胡蜂VT-1的抗毒血清研究奠定基础.
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胰腺癌术前介入化疗作用的探讨
目的探讨术前区域性动脉灌注介入化疗在局部进展期胰腺癌治疗中的作用.方法 1999～2002年,94例局部进展期胰腺癌病人随机分为术前介入化疗组(64例)和未介入化疗组(30例),比较两组病人手术切除率的差异,观察介入化疗前后肿瘤大小的改变、疼痛缓解率、血清肿瘤标志物的变化和不良反应程度,并通过免疫组化和基因芯片技术分析术前介入化疗对胰腺癌肿瘤相关基因表达的影响.结果术前介入化疗组和未介入化疗组的手术切除率分别为46.8%和23.3%(P<0.05); 术前介入化疗组部分甲基化相关基因(MBD1、E2F5和Rb)的表达明显被抑制,细胞凋亡比值(bax/bcl-2)明显增加,血清肿瘤标志物水平显著降低,病人疼痛明显缓解(P<0.05).结论术前介入化疗能明显抑制胰腺癌肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡,有助于提高手术切除率和改善病人疾病相关症状,是胰腺癌综合治疗的有效措施之一.
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小鼠白细胞介素-18的cDNA克隆及在真核细胞中初步表达的研究
目的: 克隆小鼠白细胞介素-18(IL-18)编码区的cDNA, 并实现在真核细胞中的表达.方法:用小鼠白细胞介素-18( mIL-18)的cDNA核苷酸序列,设计、合成基因序列特异性引物,应用逆转录多聚酶链反应RT -PCR,以植物血凝(PHA)和细菌脂多糖(LPS)刺激的小鼠非粘附性脾细胞的mRNA为模板,扩增获得全长mIL-1 8,转染小鼠成纤维细胞系SVT2,并进行IL-18生物学活性的检测.结果:经测序证实获得的小鼠IL-18的cDNA序列与文献报道的mIL-18的cDNA序列完全一致.构建的小鼠IL-18的重组表达载体在转染小鼠成纤维细胞SVT2后,获得具有生物学活性mIL-18的分泌表达.结论:克隆了小鼠IL-18的cDNA,并实现了在真核细胞中的表达.
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利用抑制消减杂交技术(SSH)研究与Ty21a免疫相关的基因
目的:利用抑制消减杂交技术(SSH)筛选与Ty21a免疫相关的新基因.方法:以Ty21a免疫小鼠的肠细胞为tester,以正常小鼠的肠细胞为driver,提取mRNA,反转录构建cDNA文库,利用SSH技术筛选Ty21a免疫相关的新基因.结果:通过SSH技术和cDNA徽矩阵技术,发现了7条与GenBank中已公布的表达序列标签(expressedsequence tag,EST)片段没有明显同源性,可能为Ty2Ia免疫相关的新基因.其中3条正在用RACE-PCR法进行获得全长cDNA的工作.结论:SSH技术是一种高效的差异基因筛选方法,基因表达谱芯片技术是高通量进行基因表达模式研究的方法,Ty21a可诱导多种免疫相关新基因的表达.
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人胸苷激酶基因cDNA克隆
目的克隆人胸苷激酶基因cDNA.方法采用逆转录PCR方法扩增胸苷激酶cDNA,用十二烷基氟波酯(TPA)刺激人外周血细胞的mRNA为模板;扩增的PCR产物经TA克隆重组和内切酶鉴定,以及DNA序列分析确定克隆基因的序列.结果经逆转录PCR扩增出一个700bp左右的DNA片段,TA克隆出现16个阳性克隆,选择其中的一个克隆(TKTA8)进行DNA序列分析,序列分析结果表明TKTA8克隆重组的序列是人胸苷激酶的cDNA序列.结论从外周血细胞中得到了hTK完整的开放读码框架.
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真核细胞中人神经生长因子cDNA的表达
目的构建人神经生长因子cDNA的表达载体pcDNA3.1-NGF,并在哺乳动物细胞中进行一过性表达,为以后人神经生长因子的基因治疗打下基础.方法在本研究室已克隆人神经生长因子cDNA的基础上,构建表达载体pcDNA3.1-NGF.用DEAE-葡聚糖转染技术将pcDNA3.1-NGF导入COS-7细胞,将人神经生长因子cDNA进行一过性表达,并采用Western blot方法检测表达情况,以鸡胚背根神经节的生长检测表达蛋白的生物活性.结果成功构建了表达载体pcDNA3.1-NGF,Western blot方法检测出COS-7细胞表达有目的蛋白,并具有一定的生物活性.结论用哺乳动物细胞一过性表达了人神经生长因子,并具有一定的生物活性.
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入胎脑未知基因EST的发现
目的:在人胎儿脑组织cDNA中钓取并克隆新基因.方法:以RT-PCR方法用人FGF-19特异性引物从人胎脑cDNA中扩增到一大小约660bp的片段,并连入TA克隆载体测序,得到一个表达序列标签(EST),输入GeneBank、Swissprot、dbEST等数据库中进行同源比较分析.结果:分析表明它是人胎儿脑组织未知基因EST,是一个663个碱基可编码220个氨基酸的开放读码框架.结论:在人胎儿脑组织cDNA中钓取并克隆一个人胎脑新基因EST.
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人溶菌酶cDNA在COS-1细胞及小鼠乳腺的暂态表达
目的研究自行克隆的1.5kbhLYZ双链cDNA的表达特性.方法将此cDNA亚克隆人真核表达载体pcDNA3及乳腺特异表达载体p205C3,重组载体pcDNA3LYZ转染COS-1细胞,用间接免疫荧光法检测转染细胞中hLYZ cDNA的表达;重组载体p205C3LYZ注射哺乳期小鼠,用微球菌溶解试验和斑点杂交试验检测hLYZ cDNA在小鼠体内的表达.结果hLYZ cDNA在转染的COS-1细胞中得到了正确表达;小鼠体内表达并分泌到乳汁中的hLYZ达87μg/ml,且目的基因的表达具有较好的组织特异性.结论hLYZ cDNA可在COS-1细胞中有效表达,基因构件p205C3LYZ可以用于动物乳腺生物反应器研制.
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重组人BAFF134～285的克隆及在大肠杆菌中的高效表达
目的克隆人TNF家族的B细胞激活因子(B cell activatingfactor to the TNF family,BAFF)胞外区cDNA,并进行高效表达和纯化.方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RT-PCR扩增编码人BAFF胞外区134～285氨基酸残基cDNA,经序列测定后,克隆至pQE-80L载体中,并转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达及Ni2+-NTA柱层析纯化目的蛋白,后经SDS-PAGE和Western blot检测.结果RT-PCR扩增得到了459bp的cDNA片段,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF134-285的cDNA序列一致,SDS-PAGE及Western blot证实表达蛋白确实为6 × His-BAFF134-285融合蛋白,并存在于包涵体中.结论利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF134-285,为进一步研究其生物学活性奠定了基础.
关键词： 肿瘤坏死因子 B细胞激活因子(BAFF) cDNA 克隆 原核表达 -
Sparc基因的克隆及其在HEK293细胞中的表达
目的:为探讨SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine)在人恶性肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制,进一步明确SPARC发挥作用的方式及其与肿瘤发生类型的关系.方法:我们首先提取了人乳腺癌细胞系MCF-7的总RNA,在对总RNA进行纯度与定量检测后,利用RT-PCR的方法,以该总RNA为模板,将其反转录为cDNA;再设计引物,以该cDNA为模板,利用PCR扩增出包含Sparc编码区的DNA片段,将该产物纯化后通过T-A克隆连接入pMD20-T载体,利用菌落PCR及DNA测序进行鉴定.以pMD20-T-Sparc为模板,我们设计了特异的针对Sparc全长编码区的引物,并在引物5′端分别加入BamHI、HindIⅢ酶切位点,通过PCR将Sparc编码区扩增出来,经纯化及双酶切后与真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)相连,再经菌落PCR和DNA测序进行鉴定.通过瞬时转柒的方法,利用脂质体将所构建的重组SPARC真核表达载体转染HEK293细胞,48h后裂解所培养的细胞,使用western blot检测有无SPARC的表达.结果:测序证实所克隆的Sparc编码区cDNA正确地插入pcDNA3.1myc-his(-)中,western blot检测证实其在HEK293细胞中得到表达,而空载体转染的细胞则无表达,说明所构建的pcDNA3.1myc-his(-)-Sparc能够成功表达.结论:我们成功克隆了人Sparc cDNA,构建了其真核表达载体,并在HEK293细胞中得到有效表达,从而为进一步研究人SPARC的功能及其与肿瘤的关系奠定了基础.
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人类风湿性关节炎滑膜组织cDNA文库的构建
目的:构建人类风湿关节炎(RA)滑膜组织cDNA文库.筛查与RA相关的特异基因,为探讨RA的发病机制及基因治疗奠定基础.方法:提取人类风湿关节炎滑膜组织RNA并使用Trizol法纯化mRNA;运用mRNA5'末端的模板转换方法以powerscriptTM逆转录酶进行转录,使用COS Ⅲ/3'PCR引物合成第1链cDNAs;长距离聚合酶链反应(LD-PCR)合成双链cDNA; PCR产物经蛋白酶K水解并纯化后,经SfiI酶切、柱层析洗脱,重组于TripIEx2载体并包装后,测定滴度、重组率、扩增文库,随机挑取40个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建cDNA文库的质量.结果:未扩增文库的滴度为6.89× 106pfu/mL;扩增后文库滴度为2.63× 109 pfu/mL,重组效率为93％；插入片段主要集中在300～1800bp.结论:成功构建了一个人类风湿关节炎(RA)滑膜组织cDNA文库,可以用探针抗体等做免疫学筛选,为进一步探寻与RA疾病相关的基因奠定坚实基础.
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东北林蛙皮肤中一类新抗菌肽cDNA的克隆及成熟肽的预测
为进一步研究和开发高效广谱天然抗生素的抗菌肽,本文克隆东北林蛙(Rana dybowskii)的抗菌肽基因,并预测其成熟肽的有关性质.根据蛙属抗茵肽信号肽末端序列设计简并引物,以RT-PCR技术扩增皮肤中抗菌肽的cDNA,并进行克隆测序.用生物信息学软件分析cDNA序列特点,预测成熟肽的理化性质.研究发现一种长度为28个氨基酸残基的新抗茵肽dybowsin-1,该肽具有Rana box结构;与已发现的抗茵肽仅有35%的同源性;理论等电点在9.70-10.01之间;均呈阳离子性;从第3或4个氨基酸开始到第16个氨基酸形成α-螺旋结构,极性氨基酸位于螺旋轮的一侧,非极性氨基酸位于螺旋轮的另一侧;具有N-端疏水、C-端亲水的两亲性.一个个体表达5条cDNA序列编码3种不同的dybowsin-1分子,显示出该抗菌肽表达的多样性.序列分析显示,该抗茵肽可能由多基因座位编码.
关键词： 东北林蛙 Rana dybowskii 抗茵肽 cDNA 预测 -
人Cuedc2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达
目的:构建人Cuedc2的真核表达载体,并进行体外验证.方法:提取人卵巢癌细胞总RNA,通过RT-PCR的方法其反转录为cDNA;以之为模板,利用PCR获得Cuedc2的编码区,纯化后克隆入pcDNA3.1 myc-his(-),利用菌落PCR及DNA测序进行鉴定.后,采用瞬时转染的方法,将所构建的重组CUEDC2真核表达载体通过脂质体转染HEK293细胞,48h后通过western blot检测Cuedc2蛋白的表达.结果:Cuedc2编码区cDNA正确地插入真核表达载体pcDNA3.1 myc-his(-)中,western blot检测证实其在HEK293细胞中表达,而空载体转染的细胞为阴性,表明所构建的pcDNA3.1 myc-his(-)-Cuedc2能够在体外有效表达.结论:本研究成功地克隆了人Cuedc2 cDNA,构建了重组真核表达载体,并在HEK293细胞中有效表达,为进一步研究人Cuedc2的功能及其与肿瘤的关系奠定了实验基础.
