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简并引物在克隆盐藻热休克蛋白70基因家族中的应用
目的:利用简并引物扩增盐藻热休克蛋白70(hsp70)家族.方法:根据衣藻、矮牵牛花等真核生物hsp70氨基酸高度保守序列DIDLGTT,DQGNRTTP,PAYFNDS 和 ATKDAG设计2对简并引物,以盐藻hsp70 cDNA为模板进行巢式PCR扩增,产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析.结果:得到2个分别为372 bp和354 bp编码126及118个氨基酸残基的部分cDNA片段.推导的氨基酸序列与衣藻、矮牵牛花、番茄、果蝇和酵母hsp70和hsp70b比较有高度同源性.结论:所克隆的序列为盐藻hsp70和hsp70b 部分cDNA 片段.利用简并引物筛选cDNA文库是克隆基因家族重要的方法.
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人脐静脉内皮细胞E-选择素分子克隆
目的:为探讨E-选择素结构与功能的关系.方法:采用人脐静脉内皮细胞,经分离培养及激活后,提取总RNA,用M-MLV逆转录酶将其转录成cDNA第一链,设计引物行PCR扩增.结果:其产物经电泳测定为1.9kb的片段,即E-选择素cDNA的全长编码区.先将cDNA连接至PUC-18载体并转化至JM-109中,提取质粒DNA.再将E-选择素酶切为3个片段进行序列测定,显示人脐静脉内皮细胞E-选择素与文献报道略有差异:即53位G→A;655位T→C而导致氨基酸的改变(亮氨酸→脯氨酸);1914～1916位缺失AGC(丝氨酸).结论:为进一步研究E-选择素结构与功能的关系,制备探针与单克隆抗体打下基础.
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段的克隆与分析
目的:获得杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段.方法:根据Dunaliella tertiolecta、衣藻、团藻等生物硝酸盐还原酶(nitrate reductase,NR)高度保守序列EGWWFKP、WNVMGMM设计一对简并引物,以含硝酸盐培养基培养的的盐藻cDNA为模板,进行PCR扩增,产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列,并与Dunaliella tertiolecta、团藻、衣藻、小球藻等进行同源性分析.结果:在盐藻中所获得的cDNA片段,核苷酸长度为381 bp,编码127个氨基酸.推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较:Dunaliella tertiolecta为88.2%同源,团藻为78%,衣藻为67%,小球藻为59%.结论:所克隆的序列为盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段.
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶5'端cDNA片段的快速扩增
目的:根据已扩增的杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA的部分序列,利用5'RACE的方法扩增其5'上游未知片段.方法:根据盐藻硝酸盐还原酶cDNA已知的部分序列,设计一条磷酸化反转录引物、2对特异性反向PCR引物.提取盐藻细胞mRNA,利用5'RACE的方法反转录成cDNA,然后利用PCR方法扩增5'上游序列,产物与T载体连接后转化至大肠杆菌JM109中,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析.结果:在盐藻中所获得的cDNA片段,核苷酸长度为431 bp,编码143个氨基酸.推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较:Dunaliellatertiolecta为83%,衣藻为68%,团藻为66%,小球藻为64%.结论:所克隆的序列为杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段.
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cDNA末端快速扩增技术新进展
全长cDNA的获得是基因克隆的重要内容,也是目前人类基因组研究中的一个重要方面.cDNA末端快速扩增(RACE)技术是以PCR为基础,从部分已知的cDNA序列扩增出其他未知部分的5′端和3′端的cDNA序列的一种方法.本文从RACE技术的基本原理方法出发,详细阐述了其存在的缺陷,并对RACE新研究进展,如Marathon-PCR、Smar1-RACE以及"电子"cDNA克隆等作一综述.
关键词： cDNA cDNA末端快速扩增 基因克隆 -
人类p73基因TAp73α cDNA片段克隆及鉴定
目的构建真核表达重组质粒pcDNA3.1+/TAp73α cDNA,克隆包含人类p73基因TAp73α转录本蛋白编码区的cDNA片段.方法采用RT-PCR方法获取TAp73α cDNA目的片段,构建pcDNA3.1+/TAp73α cDNA 重组质粒, 用构建的重组质粒转化大肠杆菌JM-109, 通过酶切和测序进行相应的鉴定.结果包含人类p73基因TAp73α转录本蛋白编码区的cDNA片段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1+质粒的多克隆位点,经鉴定与理论设计完全一致.结论包含人类p73基因TAp73α转录本蛋白编码区的cDNA片段已被成功克隆.
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鸡传染性支气管炎病毒LX4株mRNA5和mRNA6 cDNA的分子特征
本研究参照已发表的IBV基因序列设计合成了一对引物,经反转录-聚合酶链式反应(ReverseTranscription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术扩增得到我国地方分离株LX4 mRNA5和mRNA6的全部cDNA大小约1.7kb的片段.将该片段克隆并进行序列测定,与国内外部分参考毒株的相应序列比较分析发现:LX4 5a基因与已发表的国内外IBV毒株之间同源性很低,而这些参考毒株间5a基因同源性却很高(推导的氨基酸同源性在90%以上).5b基因与国内分离株D971同源性高.在所选的12株参考毒株中,LX4N基因推导氨基酸同源性与国内分离株SD/97/02高(94%),与HB次之(93%),与其他毒株核苷酸和推导氨基酸同源性在谮89%和92%以下.对已报道的N基因所编码蛋白的三个保守碱性区同源性比较发现,LX4在第66-88位与Beau、M41、H52及HB同源性均为100%.在第181-234位,推导氨基酸同源性与SD/97/02高(94%).在第334-373位推导氨基酸同源性与H120和ZJ971推导氨基酸同源性均为93%,与其他毒株在82%以下.同时还发现在C末端350-409位,LX4与H120推导氨基酸的同源性为100%,与HB次之(98%),与其他毒株在95%以下.以上研究结果提示:我国地方分离毒株LX4 mRNA5和mRNA6cDNA序列与国内其他分离株高,表明与国内其他分离株具有较近的遗传衍化关系.但在N基因序列比较及对N基因编码蛋白的局部功能区比较分析发现,LX4与H52和/或H120存在很高的同源性,这表明LX4的存在可能与我国应用IBV疫苗株H52和H120有一定的联系.
关键词： 传染性支气管炎病毒 mRNA5和mRNA6 cDNA 分子特征 -
Granulysin真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定. 结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达. 结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础.
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日本血吸虫成虫cDNA表达文库的构建及鉴定
目的通过构建日本血吸虫成虫cDNA表达文库,免疫筛选全长目的基因,研究其结构和功能.方法采用TRIZOL试剂提取日本血吸虫成虫总RNA,Oligotex mRNA Midi Kit分离mRNA,并用Stratagene的建库试剂盒构建日本血吸虫cDNA表达文库.结果构建的日本血吸虫成虫cDNA表达文库容量为2×106puf/ml,扩增后文库的滴度为1.4×107pfu/ml.文库的重组率达到96%以上,插入片段平均长度为1.4kb.结论本文库可望用于日本血吸虫疫苗候选基因及诊断抗原分子的筛选.
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cDNA代表性差异分析:方法及其应用
分析基因表达的差异不仅在研究发育、分化、突变等领域有着极大的应用价值,已成为基因克隆非常有效的手段之一.cDNA代表性差异分析(cDNA RDA)是新近出现的一种新的、具有一定优越性的mRNA差异表达分析方法,本文简要介绍了cDNA RDA的原理、方法,以及它和其它几种常用的mRNA差异表达分析技术如DD-PCR、消减杂交、抑制消减杂交等进行了比较.
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cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端延伸快速分离全长cDNA序列
建立一种cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端快速扩增分离人类新基因全长cDNA序列的新技术.以文库载体序列与待扩增目的基因片段为模板各设计引物进行热启动聚合酶链反应扩增,从人胎肝cDNA文库中获得氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化过程中差异表达序列标签片段(FRG4)的全长cDNA序列,聚合酶链反应产物克隆到pGEM-T载体中,并测序鉴定,从而成功获得FRG4的全长cDNA序列.该技术是一种快速有效的分离人类新基因全长cDNA序列的方法.
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日本血吸虫新基因的克隆及分析
目的:克隆并分析日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)新基因,提供有效的疫苗候选分子.方法:用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析.结果:共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8(GenBank注册号AF517843)和Sj肌球蛋白cDNA序列(GenBank注册号AY770506),分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断.结论:Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料.
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人鼻咽上皮细胞CYP 2E1 cDNA克隆及序列分析
目的:比较正常人胚鼻咽上皮(HENE)细胞、二亚硝基哌嗪转化的人胚鼻咽上皮(HENE)所建的细胞系(7 429)、鼻咽癌细胞系(HNE1)细胞色素P450 2E1(CYP2E1)mRNA表达序列,探讨CYP2E1在鼻咽癌变过程中的作用特点.方法:采用RT-PCR方法和DNA重组技术从HENE,7 429,HNE13种细胞系中克隆的CYP2E1cDNA片段,测序并分析其结构改变特征.结果:①与HENE-2E1比较,7 429-2E1存在846位(A→T)、901位(A→G)两个点突变;HNE1-2E1存在901位(A→G)一个点突变.②与成人肝来源的 CYP2E1 CDs 序列(GenBank号为J02843)比较,发现HNE1-2E1序列与其完全匹配;HENE-2E1序列存在901位(G→A)点突变.但上述突变对应部位氨基酸序列并无改变.结论:鼻咽癌发生过程中CYP2E1基因cDNA序列仅存在少数无义突变,表现出其高度保守性.
关键词： 细胞色素P450 2E1 鼻咽癌细胞系 cDNA RT-PCR 序列分析 -
人细胞色素P450 ZE1 cDNA在鼻咽癌细胞系CNE-2的稳定表达
目的:为进一步研究人细胞色素P450 E1(cytochro me P450 2E1, CYP2E1)蛋白对相关化学致癌物的体外代谢功能及其在化学物质鼻咽癌(nas opharyngeal carcinoma, NPC)变中的作用机制提供体外模型.方法:应用基因重组技术构建人CYP2E1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-2E1,并经脂质体介导转入CNE2细胞,通过G418筛选后挑选若干抗性细胞克隆扩大培养.结果:经Southern blot和Western blot对一系列抗性克隆细胞进行检测,获得2个具有外源CYP2E1 cDNA基因稳定整合和表达的细胞克隆C NE2-2E1-1及CNE2-2E1-2.结论:建立了可供CYP2E1代谢相关的化学致癌物筛选及CYP2E1在N PC癌变中作用机制研究的体外模型.
关键词： 细胞色素P450 2E1 cDNA 表达 体外模型* -
差异显示cDNA转染DC细胞在肿瘤生物治疗中作用
目的 通过差异显示技术筛选肿瘤细胞差异性基因并转染到树突状细胞中,验证转染后DC所诱导的CTL杀伤效能.方法 将Lewis肺癌细胞种植在C57BL/6J小鼠后,取肿瘤组织和正常组织进行差异显示反转录PCR技术分析鉴定,得到的差异显示基因经测序后,构建pcDNA3.1-DD-cDNA质粒,经脂质体转染至未成熟树突状细胞中.分别通过体内体外实验检验树突状细胞诱导的细胞毒T细胞的杀伤活性.结果 筛选出Lewis肺癌细胞的一条DD-cDNA的长度为730 bp,通过与Genbank序列数据库进行同源性比对,未发现同源性信息,为一全新基因.体内试验和体外试验中cDNA转染组CTL对肿瘤细胞杀伤效果均明显强于单纯肿瘤裂解物刺激组.结论 Lewis肺癌细胞表达一条肿瘤特异性基因,将其转染到树突状细胞中后,可以明显增强树突状细胞诱导的CTL的杀伤活性.
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大鼠神经元Arnt2基因cDNA序列的分析
目的克隆并分析神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA.方法以大鼠大脑Marathon Ready cDNA为模板,采用SMART RACE技术克隆神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA,产物亚克隆到pGEM-T easy质粒载体后进行序列测定以及同源性分析.结果经过3次5′RACE扩增,得到的5号EST cDNA长度为5 663bp,其中包含1个2 136bp的完整的开放读码框序列,与已知大鼠基因芳香烃受体核转住因子2(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2,Arnt2)完全同源;该cDNA 3′端非编码区长达3323 bp,包含3个AATAAA加尾信号和1个由12个腺嘌呤核苷酸组成的polyA序列.结论5号EST目标基因为大鼠基因Arnt2,该基因3′端完整的非编码区cDNA序列为首次报道.神经元凋亡差异表达基因Arnt2的克隆鉴定为深入研究小脑颗粒神经元低钾性凋亡机制奠定了基础.
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胰腺十二指肠同源框基因PDX-1的体外扩增
目的提取大鼠胰岛细胞瘤细胞株的RNA,以其中的mRNA为模板,扩增胰腺十二指肠同源框-1(Pancreatic Duodenal Homeobox-1)编码基因,并测定核苷酸序列,为进一步克隆及表达PDX-1cDNA奠定基础.方法采用TIZOL方法进行RNA提取;通过RT-PCR方法扩增大鼠PDX-1cRNA;琼脂糖凝胶电泳检测后进行序列测定.结果从大鼠胰岛细胞瘤细胞中提取了RNA,以其中的mRNA为模板扩增出大鼠PDX-1基因,经琼脂糖凝胶电泳鉴定为目的片断,经序列测定与Genebank公布的序列一致.结论在国内首次成功的克隆了PDX-1基因.扩增时在5'端以限制性酶切位点进行限制,对进一步进行其克隆、表达研究以及对其生物学功能进行研究奠定了基础.
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一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定
目的 克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)新基因--胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列.方法 根据表达序列标签(expression sequence tag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列:利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析.根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(open readingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序.重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a(+)中.结果 克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白.构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段.结论 克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a(+)-AcCOL.
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亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因的克隆和分析
目的 分析和预测亚洲带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1,EF-1)基因及其编码的蛋白的结构和功能.方法 利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,http://ca.expasy.org/)中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别延伸因子-1的全长编码基因并预测其蛋白的结构和功能.结果 该基因是全长基因,长度988bp,编码区为67～868,编码269个氨基酸,无跨膜区;与GenBank中细粒棘球绦虫同源基因的一致性达87%,相似性达91%;预测三个主要的抗原表位位于135～140,126～131,157～162.结论 应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出EF-1基因.
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亚洲带绦虫肌动相关蛋白2/3复合体结构与功能的生物信息学分析
目的 分析和预测亚洲带绦虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4(Actin related protein 2/3 complex subunit 4,Atp2/3)基因及其编码蛋白的结构和特性.方法 利用美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,http://ca.expasy.org/)中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,如Pcgene和Vector NTI suite,从亚洲带绦虫全长cDNA质粒文库中识别Arp2/3基因及其编码区,分析、预测该基因编码蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等.结果 该基因全长718 bp,编码区为30-530,编码167个氨基酸,为全长基因.GenBank中与日本血吸虫Arp2/3氨基酸序列一致性达78%,相似性达90%.理论分子量为19533.9.没有跨膜区和各种亚细胞序列.预测3个主要的抗原表位为53～58,74～82,138～143均在Arp2/3空间结构的分子表面.结论 应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Arp2/3基因.
