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不同放射敏感性的鼻咽癌细胞中ATM/PI3 K区基因突变的研究
目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞(CNE1、CNE2)中ATM/PI3K区基因突变的情况.方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和荧光标记的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)循环测序方法,对不同放射敏感性的鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2中ATM/PI3K关键区域进行突变检测.结果所测CNE1、CNE2中的ATM/PI3K区序列中没有发生突变.结论鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2内在放射敏感性的差异可能由ATM/PI3K区基因突变以外的因素所决定.
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塞来昔布联合放射对人鼻咽癌细胞生物效应的研究
目的 探讨COX-2选择性抑制剂塞来昔布联合放射对CNE-1细胞存活和凋亡的影响,并初步探讨其与药物浓度之间的相关性.方法 选择鼻咽癌CNE-1细胞系作为实验对象,以药物浓度0、1.25、2.50、5.00 μmol/L设A、B、C、D实验组.4个组分别予6 MVX线照射0、2、4、6 Gy后分别行成克隆实验、流式细胞仪检测细胞存活分数(SF)及细胞早、晚期凋亡率.结果 B、C、D组与A组之间SF值及晚期凋亡率差异有统计学意义(P＜0.05);B组与C、D组之间差异有统计学意义(P＜0.05);C组与D组间SF值、晚期凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05);各组间早期凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 塞来昔布联合放射对CNE-1细胞存活下降和晚期凋亡增加有影响,并随药物浓度增加而增加,且在2.50 μmol/L达高值,但对早期凋亡无影响.
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不同敏感性鼻咽癌细胞株中Ku蛋白表达情况比较
目的比较作为DNA双链断裂修复蛋白DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)的调节亚基70 Ku、80 Ku在不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中的表达情况.方法成克隆实验测定鼻咽癌高分化鳞癌细胞CNE1和低分化鳞癌细胞CNE2不同剂量照射后的存活分数,用线性二次模型拟合剂量存活曲线并求出放射生物学参数α、β、SF2、MID以评价两株细胞的放射敏感性.Western blot检测照射前和后不同时间及不同剂量CNE1、CNE2细胞中Ku的表达,检测蛋白条带的吸光度值做半定量分析.结果 CNE1在各个剂量点的存活分数均比CNE2高,MID也大于CNE2(2.35:1.11),SF2也大于CNE1(0.54:0.37).Western blot显示两株细胞中70 Ku、80 Ku均有表达,蛋白条带的吸光度值测定显示70 Ku在CNE1、CNE2细胞中分别为20.03±7.56和19.36±6.04,80 Ku分别为25.98±12.87和23.74±9.24(P值均>0.05).蛋白表达的定量和定性分析同样显示4 Gy照射后不同时间点及0～16 Gy照射后12 h Ku的表达无统计学差异.结论实验验证了CNE2比CNE1对放射更敏感;照射前后两个细胞均有70 Ku、80 Ku蛋白表达且无差异;CNE1、CNE2放射敏感性的差异与Ku蛋白表达量无明显关系.
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泰素联合放射对人鼻咽癌细胞的作用
目的研究泰素(Taxol)结合放射对人鼻咽癌细胞系(CNE)的联合作用效应.方法用克隆形成法制作细胞存活曲线,流式细胞分析测定细胞周期分布.Tunel法作细胞凋亡测定.结果不同浓度的Taxol与CNE细胞作用24h,其细胞毒性呈剂量依赖性.在放射增敏实验中,100nmol/L Taxol作用24h,对CNE细胞有放射增敏作用,增敏比为1.23.同样剂量的Taxol作用同样时间,可诱导CNE细胞的G2+M期阻滞.Tunel法测定细胞凋亡,10μmol/L Taxol作用24h,可诱导CNE细胞凋亡,X射线照射2Gy也可诱导CNE细胞凋亡,而10μmol/L Taxol与2Gy X射线同时作用,诱导凋亡明显增加.结论 Taxol对CNE细胞有放射增敏作用,除自身对细胞凋亡有诱导作用外,还能增强放射对CNE细胞凋亡的诱导作用.
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用蛋白质组学技术分析鼻咽癌细胞系放射生物学特性的初步结果
目的 应用蛋白质组学技术观察不同鼻咽癌细胞系中蛋白表达的差异,以期寻找与鼻咽癌细胞系放射生物学特性相关的蛋白.方法 提取细胞总蛋白进行双向凝胶电泳、MALDI-TOF肽质谱指纹图分析、质谱数据的蛋白质库搜寻鉴定.应用Western Blot检测细胞中蛋白质表达.结果 差异表达为显著的蛋白质有9个,与5-8F细胞比较6-10B细胞中4个为下调蛋白,5个为上调蛋白.Western Blot证实CK19和p73在5-8F和6-10B中的表达与蛋白质组结果一致,p73在5-8F中的表达高于6-10B,CK19在6-10B中的表达高于5-8F.结论 放射生物学特性不同的鼻咽癌细胞系中存在差异表达蛋白,这可能与其放射生物学特性有关,其中p73可能成为预测的侯选标志物.
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不同p53功能状态鼻咽癌细胞株的放射生物学特性
目的探讨鼻咽癌细胞不同p53功能状态及其放射生物学特性之间的关系.方法采用脂质体介导的转染方法将携带野生型p53基因的真核表达质粒pC53-SN3,空载体质粒pCMV-Neo-Bam分别转染到鼻咽癌细胞CNE1、CNE2中.p53功能检测技术明确细胞转染p53基因前后的p53功能状态.成克隆实验测定细胞存活分数.采用单击多靶模型和线性二次函数模型拟合细胞存活曲线,求出放射生物学参数D0、Dq、N和αβ、α/β、SF2值.结果转染野生型p53基因后鼻咽癌细胞获得正常p53功能.CNE1-pNeo和CNE1-wtp53细胞的D0值分别为1.17、1.08Gy;Dq值分别为2.25、1.21Gy;α值分别为0.13、0.29Gy-1;SF2值分别为0.765、0.326.CNE2-pNeo和CNE2-wtp53细胞的D0值分别为0.92、0.84Gy;Dq值分别为1.45、1.04Gy;α值分别为0.13、0.76 Gy-1;SF2值分别为0.675、0.156.CNE1、CNE2细胞转染野生型p53基因后,D0、Dq、SF2值均减小,α值增大.结论野生型p53基因转染可以提高p53功能缺陷的鼻咽癌细胞的放射敏感性.
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Ku蛋白表达与鼻咽癌细胞放射敏感性关系初探
目的 探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1(鼻咽高分化鳞癌细胞株)、CNE-2(鼻咽低分化鳞癌细胞株)中DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的凋节亚基Ku70、Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系.方法 通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数,并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值,以及四氮唑蓝比色分析法(MTT法)检测60Co γ射线4 Gy照射后的细胞群体生长情况,以评价两株细胞的放射敏感性.逆转录实时荧光定量PCR技术(RT-FQ-PCR)检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平Ku70、Ku80基因的定量表达.结果 CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高,MID值分别为2.78、1.61,SF2值分别为0.627、0.341;4 Gy照射后的存活率分别为88.2%、72.3%;RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有Ku70、Ku80基因的表达,其相对表达量之比分别为1.76±0.54(P=0.07)、13.82±3.78(P=0.004),Ku80基因在CNE-2细胞中存在剂量依赖关系.结论 实验验证了CNE-2比CNE-1对射线更敏感,Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关.
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uPA,uPAR,PAI-1在具有不同转移率的鼻咽癌细胞系中的表达
目的:研究尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen ac tivator ,uPA)和它的受体(uPAR)、抑制剂(PAI-1)在具有不同转移率的鼻咽癌细胞系CNE-2Z(20%淋巴道转移)、CNE-2Z-H5(40%淋巴道转移)、CNE-2Z-H5-9(90%淋巴道转移)中的表达.方法:应用逆转录聚合酶反应(RT-PCR)方法检测uPA,uPAR,PAI-1在基因转录水平的表达.结果:uPA,uPAR mRNA在CNE-2Z-H5-9中表达高,在CNE -2Z中表达低;PAI-1 mRNA在CNE-2Z-H5-9中无表达,在CNE-2Z,CNE-2Z-H5有表达,但差异无显著性.结论:uPA、uPAR可能促进鼻咽癌细胞侵袭、转移,PAI-1可能起抑制作用.
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EGF和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定
目的 构建能表达靶向EGF RmRNA 和IGF-1 RmRNA的siRNA真核表达质粒.方法 从GeneBank 中搜索EGFR(NM 000875)和IGF-1 R(NM 201283)基因组标准序列,根椐siRNA设计原理各基因选取两段19bp的碱基序列作为靶目标,并根据其序列构建真核表达质粒.随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列,构建表达siRNA的真核表达质粒作为质粒对照psiPC.转染后分别培养12h、24h、36h、48h、60h、72h,以转染率高的时间点的鼻咽癌细胞做流式细胞仪检测转染率,并采用共聚焦显微镜检测质粒绿色荧光蛋白的表达.结果 质粒psiEGFR1、psiEGFR2、psiIGF-1 R1、psiIGF-1 R2和psiPC酶切后均可见400bp小带,与预期插入的目的 基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;经荧光显微镜下摄片计算转染效率发现:在转染48h达高(55%~60%之间);流式细胞仪检测转染后48h的转染率为57.45%,共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达绿色荧光.结论 本实验构建了靶向EGFRmRNA和IGF-1 RmRNA、表达短发夹RNA (shRNA)的真核表达质粒.重组质粒能有效转染人鼻咽癌细胞并在其中表达,能下调鼻咽癌细胞EGFR和IGF-1 R的表达.
关键词： 小干扰RNA 表皮生长因子受体 胰岛素样生长因子受体 鼻咽癌细胞系 -
人鼻咽上皮细胞CYP 2E1 cDNA克隆及序列分析
目的:比较正常人胚鼻咽上皮(HENE)细胞、二亚硝基哌嗪转化的人胚鼻咽上皮(HENE)所建的细胞系(7 429)、鼻咽癌细胞系(HNE1)细胞色素P450 2E1(CYP2E1)mRNA表达序列,探讨CYP2E1在鼻咽癌变过程中的作用特点.方法:采用RT-PCR方法和DNA重组技术从HENE,7 429,HNE13种细胞系中克隆的CYP2E1cDNA片段,测序并分析其结构改变特征.结果:①与HENE-2E1比较,7 429-2E1存在846位(A→T)、901位(A→G)两个点突变;HNE1-2E1存在901位(A→G)一个点突变.②与成人肝来源的 CYP2E1 CDs 序列(GenBank号为J02843)比较,发现HNE1-2E1序列与其完全匹配;HENE-2E1序列存在901位(G→A)点突变.但上述突变对应部位氨基酸序列并无改变.结论:鼻咽癌发生过程中CYP2E1基因cDNA序列仅存在少数无义突变,表现出其高度保守性.
关键词： 细胞色素P450 2E1 鼻咽癌细胞系 cDNA RT-PCR 序列分析 -
EB病毒LMP1促鼻咽癌细胞生长与CD23、bcl-2表达和凋亡的关系
目的:探讨EB病毒LMP1表达促鼻咽癌细胞系生长作用与CD23、bcl-2表达和细胞凋亡的关系.方法:用免疫组化LSAB法检测LMP1、CD23和bcl-2蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用DNA电泳法、流式细胞法和TUNEL法检测癌细胞凋亡;用CD23单抗阻断和MTT法观察CD23单抗对鼻咽癌细胞系生长的影响.结果:表达LMP1的鼻咽癌细胞系(L-CNE1)的生长能力明显增强,并有CD23蛋白表达,而非表达LMP1的鼻咽癌细胞系(V-CNE1和CNE1)的CD23表达阴性;3种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生,而都仅有2%～3%的细胞表达bcl-2蛋白;CD23单抗能明显地抑制L-CNE1细胞系的生长,但对V-CNE1和CNE1细胞系的生长无明显影响.结论:提示LMP1促鼻咽癌细胞系生长可能是通过上调CD23所致,而与bcl-2的表达和细胞凋亡无关.
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p16基因的表达上调对鼻咽癌细胞恶性表型的影响--p16基因在鼻咽癌中的改变系列研究(Ⅱ)
目的:探讨上调p16基因的表达对鼻咽癌细胞恶性表型逆转的作用,为p16基因在鼻咽癌发病过程中具有一定的作用提供直接的证据.方法:本文采用电穿孔的方法向p16基因表达下调的鼻咽癌细胞系HNE1中导入全长野生型的p16cDNA,通过G418筛选获得可以稳定传代的转染细胞系.对其中4个转染细胞系以PCR和Northern杂交鉴定转染细胞系中外源p16cDNA整合以及p16基因表达的状况.并借助比较细胞倍增时间,流式细胞计数和裸鼠接种的方法对转染细胞的恶性表型进行了检测.结果:在所鉴定的4个转染细胞系中有一个转染细胞?#4-2)不仅整合了外源p16cDNA,且p16基因的表达明显增高.与未转染的鼻咽癌细胞系HNE1及未整合外源p16cDNA的转染细胞系相比,#4-2细胞的倍增时间延长,停滞于G1期的细胞数明显增多,接种裸鼠后肿瘤形成的潜伏期延长.结论:以上实验结果证实p16基因在鼻咽癌的发生过程中确实具有一定的作用,它的表达上调可以促进鼻咽癌细胞恶性表型的逆转.
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肿节风浸膏溶液对鼻咽癌细胞系CNE-2的放射增敏作用
目的:探讨肿节风浸膏对鼻咽癌细胞系CNE-2的细胞毒性作用以及对放射敏感性的影响.方法:应用克隆形成方法,观察不同浓度的肿节风浸膏对CNE-2的细胞杀灭效应,求得IC50,选择合适浓度的肿节风浸膏配合照射和单纯照射对细胞的杀伤作用,计算细胞存活率,用多靶单击数学模型进行曲线拟合作图.结果:与照射配合的肿节风浸膏的合适浓度为10 mg/L.单纯照射组D0值为3.096 Gy,照射加肿节风浸膏组D0值为2.441 Gy,放射增敏比(SER)为1.268(3.096/2.441).结论:肿节风浸膏具有一定的放射增敏作用.
