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小型猪CYP3A88基因克隆与其他动物的序列比较
目的 克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88基因,并进行生物信息学分析.方法 应用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术对其全长进行扩增,测序,利用Internet和GenBank数据库对其序列进行生物信息学分析.结果首次克隆并鉴定了我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中CYP3A88(GenBank登录号:EF625347)的编码区,获得大小为1965 bp的全长cDNA,编码区长为1512bp,编码503个氨基酸;比较核苷酸序列,与小型猪CYP3A39相似性高达94%,而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86%以下;推导和分析氨基酸序列表明,与小型猪CYP3A其它成员(CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22)进行对比,其相似性分别为92%,89%,80%,而将小型猪与人的CYP3A分别比对,小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性高,为77%;对其二级结构预测,它可能含12个α螺旋,4个β折叠;经NCBI上的CDD程序分析可知,其39-491氨基酸区域为P450 3A亚家族保守结构区域;经聚类分析,小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系;通过同源建模法对其在线建模,人CYP3A4晶体结构作为其模建模型,得到了其经典的三维结构.结论 在猪CYP3A家族四个基因中,CYP3A88在序列和高级结构上均与人CYP3A4的为相似.
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铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析
目的 克隆铁皮石斛Dendrobium officinale倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase,SES)基因,分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导下的表达模式.方法 采用RACE技术克隆铁皮石斛SES (DoSES) cDNA全长,利用相关软件和在线网站对其进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术分析DoSES的表达模式.结果 获得的DoSES cDNA序列(GenBank登录号为KX278311)全长1 890 bp,含有1个1 659 bp的完整开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸的多肽链,与其他科属植物的同源性达到60％左右.DoSES基因在铁皮石斛茎中表达量高,从高到低依次是叶、花、原球茎、根;且受到MeJA的诱导.结论 克隆了铁皮石斛DoSES基因,为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了理论基础.
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RACE策略扩增EDAG-1基因3'端及序列分析
目的 通过RACE(rapid amplification of cDNA Ends)技术分析K-562细胞株中高表达的EDAG-1基因3'端.方法 采用Marathon-ReadyTM cDNA 方法扩增HLCM cDNA (人白血病细胞株K-562,Marathon-ReadyTM cDNA)的EDAG-1基因3'端,将扩增的特异带回收纯化,构建到原核表达载体中,提取质粒并且测序分析.结果 第1次扩增、第1次巢式PCR扩增未见明显特异带,2次巢式PCR结果可见200 bp特异带,回收后连接到pMD 18-T中,转化到大肠杆菌中并筛选阳性菌落,提取质粒测序,结果未发现该段序列存在点突变、插入或缺失.结论 EDAG-1基因在白血病细胞株K-562中高表达的机制可能与3'端无关.
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白桂木凝集素基因的5'RACE与3'RACE扩增及序列分析
[目的]对白桂木凝集素基因进行扩增及序列分析.[方法]采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到白桂木凝集素(AHL)基因的保守区域、5'末端及3'末端.用VectorNTI软件将测序得到的AHL cDNA的保守区域、5'末端、3'末端进行校正、拼接得到完整AHLcDNA序列.[结果]全长含有933个核苷酸.其推导的氨基酸序列NCBI做BLAST比对,相似度高达70％～80％.[结论]对白桂木凝集素基因的cDNA序列进行研究,可为进一步从分子水平探明白桂木凝集素的作用机制提供科学依据.
