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人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达
目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因cDNA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hPTP1B)并在大肠杆菌中高效表达.方法 取2型糖尿病人(BMI＞28 kg·m-2)的淋巴细胞提取总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收构建克隆载体pMD-hPTP1B,测序后设计带酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE后用Western blot检测其特异表达,并进一步对rhPTP1B诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化.结果 测序证实所得的hPTP1BcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hPTP1B的双酶切结果与预期大小完全一致,IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式.IPTG诱导的佳浓度是0.05 mmol·L-1,时间为5 h,温度为37℃.结论 成功克隆了人PTP1B基因,构建了相应的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化,使其能在DE3中高效表达,为筛选高特异的小分子抑制剂和制备相应的单克隆抗体打下坚实的基础.
关键词： 蛋白酪氨酸磷酸酶1B cDNA pET-28a(+) 高效表达 包涵体 -
人肝细胞核因子-1β基因cDNA全长的克隆与表达
目的 构建人肝细胞核因子-1β (hHNF-1β)基因cDNA全长的原核表达质粒[pET-28a(+)-hHNF-1β]并在大肠杆菌(E.Coli)中高效表达.方法 提取正常成人肝脏组织的总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收,构建克隆载体pMD-HNF-1β,设计带酶切位点BamHⅠ和Hind Ⅲ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,测序后IPTG诱导表达,Western blot检测其特异表达,并对重组hHNF-1β(rhHNF-1β)诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化.结果 测序证实所得的hHNF-1β cDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hHNF-1β的双酶切结果与预期大小完全一致.IPTG诱导的佳浓度是0.04 mmol/L,时间为6 h,温度为37℃.结论 成功克隆和构建了hHNF-1β基因的原核表达载体并对诱导表达的条件进行了优化,为进一步的功能分析奠定基础.
关键词： 肝细胞核因子-1β pET-28a(+) 高效表达 包涵体 -
可溶性巨噬细胞集落刺激因子受体基因的克隆和原核表达
目的:克隆可溶性巨噬细胞集落刺激因子受体(sMR)基因,在大肠杆菌中表达,经纯化、复性后获得活性蛋白.方法:从人骨髓细胞中提取总RNA,在sMR基因引物两端分别加上NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点,利用RT-PCR技术扩增sMR基因,经NdeⅠ和BamHⅠ酶切后连接到表达载体pET28a,测序证实克隆基因的正确性,并在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,采用his-tag纯化柱纯化目的蛋白,并经复性处理,配体结合实验证实蛋白活性.结果:限制性内切酶切出了预期条带,测序证实了克隆基因的正确性,sMR经诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,表达蛋白经纯化和复性处理,获得了具有活性的功能蛋白.结论:成功克隆与表达了sMR基因,得到了具有活性的功能蛋白,为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础.
关键词： 受体 可溶性巨噬细胞集落刺激因子 克隆 原核表达 pET-28a(+) 蛋白质复性 -
Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
目的 构建Apoptin的原核表达载体,并制备抗原物质Apoptin融合蛋白.方法 在获得Apoptin融合基因的基础上,成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的 蛋白.结果 转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约17 000的位置出现目的 蛋白条带,大小与Apoptin融合蛋白一致.结论 Apoptin原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白,为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础.
关键词： apoptin 原核表达载体 pET-28a(+) 大肠杆菌
