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杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白基因的克隆及原核表达
目的:构建杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化融合蛋白.方法:根据GenBank上杜氏盐藻MAR结合蛋白的cDNA全长序列设计出含有特定酶切位点的引物,PCR法获得MAR结合蛋白基因序列全长,将其克隆至载体pMD18-T中.酶切连接到pET-28a(+)上构建原核表达载体pET-MBP,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,Western blotting检验其表达结果.结果:重组质粒经酶切、PCR、测序鉴定,成功构建了原核表达载体pET-MBP,对表达的融合蛋白的Western blotting分析结果表明表达的蛋白质为目的蛋白.Ni2+亲和层析法纯化蛋白质,纯化后目的蛋白在总蛋白中的含量约为70%.结论:成功地克隆杜氏盐藻MAR结合蛋白基因的全长并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,且纯化了MAR结合蛋白的融合蛋白.
关键词： 杜氏盐藻 核基质附着区 核基质附着区结合蛋白 原核表达 -
杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白cDNA片段的克隆及序列分析
目的:克隆杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白片段.方法:根据多种生物MAR结合蛋白氨基酸的高度保守序列EWYGWHF和KYGLIYQ,设计一对简并引物,以杜氏盐藻的cDNA为模板,进行PCR扩增,PCR产物与T载体相连,转化大肠杆菌JM109后,筛选鉴定,对阳性菌落进行测序分析.将测序结果推导成氨基酸序列,与GenBank上其他物种MAR结合蛋白序列进行同源性分析.结果:在杜氏盐藻中得到的cDNA片段,核苷酸长度为474 bp,编码158个氨基酸(GenBank收录号为DQ124215).推导的氨基酸序列与稻、莲、拟南芥、豌豆、烟草、酵母、果蝇和蟾的MAR结合蛋白相比较,同源性分别为74%、73%、73%、73%、71%、70%、68%和67%.结论:所克隆的序列可能为杜氏盐藻MAR结合蛋白片段.
关键词： 杜氏盐藻 核基质附着区结合蛋白 cDNA 简并引物
