首页 > 文献资料
-
人骨髓间充质干细胞表型转化为汗腺细胞的体外研究
目的研究体外人骨髓间充质干细胞(MSCs)和汗腺细胞(SGCs)直接和间接共培养条件下骨髓间充质干细胞的表型转化及其机制. 方法体外分别分离培养、扩增并鉴定MSCs和汗腺细胞.将培养的MSCs和经47℃高温处理造成热休克的SGCs直接和间接共培养,1周后,采用免疫细胞化学染色法和流式细胞仪法检测共培养体系中MSCs的表型改变,Western blot测定细胞外信号调节激酶(ERK)和磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)表达. 结果 MSCs和SGCs均呈克隆样生长,MSCs 表达CD44、CD105和CD29,不表达CD34、CEA、CK19和CK7;SGCs 表达CEA、CK19、CK8和CK7.MSCs与经高温损伤后的SGCs共培养1周后,部分MSCs呈汗腺细胞表型,间接共培养结果示各组MSCs均表达水平相当的ERK,但pERK水平表达不同. 结论成人MSCs和热休克的SGCs直接和间接共培养均可诱导MSCs向SGCs表型转化,pERK途径参与这一过程.
-
温阳化浊通络方对Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化及迁移的影响
目的：探讨温阳化浊通络方含药血清对Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化及迁移的影响。方法：通过对Wistar大鼠灌胃制备温阳化浊通络方含药血清，体外培养正常人皮肤成纤维细胞，分为空白对照组、Wnt组和温阳化浊通络方组，作用24，48，72 h后，分别用RT-PCR和Western blot法检测α-SMA mRNA及蛋白的表达，Transwell试验检测成纤维细胞迁移情况。结果：与空白对照组比较， Wnt组在不同作用时间下能诱导人皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达（P<0.01），增加其迁移数量（P<0.01）；与Wnt组比较，温阳化浊通络方组在不同作用时间下能够显著抑制Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达（P<0.05，P<0.01），同时阻止其迁移（P<0.01）。结论：温阳化浊通络方含药血清能抑制Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化及迁移，具有阻止或延缓系统性硬化病纤维化的潜能。
-
缺氧对人真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化的影响及其机制
目的 探讨缺氧对人真皮Fb向肌Fb表型转化的影响及其机制. 方法 取对数生长期第3代健康成人真皮Fb,用含体积分数10％ FBS的DMEM培养基培养,进行以下5项实验.(1)实验1、2、3均将所取细胞按随机数字表法分为常氧组、缺氧组,每组10皿.常氧组细胞于含体积分数21％氧气环境中培养,缺氧组细胞于含体积分数1％氧气环境中培养.培养0、48 h,2组分别取5皿细胞,实验l用实时荧光定量RT-PCR法检测细胞中肌Fb标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达,实验2用蛋白质印迹法检测细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达,实验3用蛋白质印迹法检测细胞中NF-κB蛋白表达.(2)实验4将细胞按随机数字表法分为常氧组、缺氧组、缺氧±吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)组,每组5皿.前2组细胞同实验1处理,缺氧+ PDTC组细胞同缺氧组细胞处理并在培养基中加入4 mL终物质的量浓度为10 μmol/LPDTC.培养48 h,蛋白质印迹法检测各组细胞中NF-κB蛋白表达.(3)实验5将细胞按随机数字表法分为常氧组、缺氧组、缺氧+ PDTC组、常氧+PDTC组,每组5皿.前3组细胞均同实验4处理,常氧+ PDTC组细胞同常氧组细胞处理并在培养基中加入4 mL终物质的量浓度为10 μmol/L PDTC.培养48 h,蛋白质印迹法检测各组细胞中αα-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验. 结果 (1)与常氧组相应时相点比较,缺氧组Fb培养0h时α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达量以及NF-κB蛋白表达量均无明显变化(t值为-1.21 ～2.04,P值均大于0.05),培养48 h时α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达量以及NF-κB蛋白表达量均显著升高(t值为-12.57～-3.44,P值均小于0.01).(2)培养48 h,缺氧组Fb中NF-κB的蛋白表达量为0.83 ±0.12,显著高于常氧组的0.17 ±0.06(t=-16.96,P＜0.001);缺氧+PDTC组Fb中NF-κB蛋白表达量为0.31±0.08,显著低于缺氧组(t =12.73,P＜0.00l).(3)培养48 h,缺氧组Fb中α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达量分别为0.73 ±0.09、1.25±0.10、1.16±0.07,显著高于常氧组的0.14 ±0.06、0.87±0.08、0.77 ±0.13(t值为9.24～11.24,P值均小于0.001);常氧+PDTC组Fb中α-SMA蛋白表达量为0.24±0.07,显著高于常氧组(t=4.22,P＜0.01),Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达量分别为0.25±0.06、0.32±0.11,显著低于常氧组(t值分别为-4.31、-3.88,P值均小于0.01);缺氧+PDTC组Fb中α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达量分别为0.09±0.08、0.38±0.12、0.47 ±0.08,显著低于缺氧组(t值为11.78 ～22.98,P值均小于0.001). 结论 缺氧能够显著上调人真皮Fb中α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达,其可能促进了Fb向肌Fb的表型转化,且可能与NF-κB信号通路的激活有关.
-
Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制
目的 了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制.方法 采用酶消化法分离培养人正常皮肤真皮Fb.(1)实验1.按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10 ng/mL重组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150 ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fb β连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平.(2)实验2.按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验1;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10 μmol/L SB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+ SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况.各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验.结果 (1)实验1.①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823).②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=16.713,P=0.001).与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82±0.17,t值分别为3.028、3.727,P＜0.05或P＜0.01).TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01).③α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为6.759、2.535,P＜0.05或P＜0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P＜0.01).④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组、TGF-β1+ Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.53±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001).与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P＜0.05或P ＜0.01);TGF-β1 +Wnt3a组低于TGF-β1组(t =4.123,P＜0.01).(2)实验2.①α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=34.101,P=0.001).SB415286组明显低于对照组(t =2.511,P＜0.05),TGF-β1+SB415286组明显低于TGF-β1组(t=3.587,P＜0.01).②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F =11.381,P=0.003).SB415286组显著低于对照组(t=2.364,P＜0.05),TGF-β1+ SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P＜0.05).③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组Fb α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t =11.198,P＜0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+ SB415286组表达较TGF-β1组显著减少(t=5.902,P＜0.01).结论 Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fb细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用.
-
烧伤创面水疱液对人骨髓间充质干细胞体外培养及表型转化的影响
目的 了解烧伤水疱液对人骨髓间充质于细胞(MSC)体外培养及表型转化的影响.方法 体外分离、培养、扩增、鉴定人骨髓MSC,收集烧伤患者伤后12、24、48 h水疱液,分别加入MSC培养液中.分为水疱液1组:MSC培养液中加入伤后12 h水疱液;水疱液2组:MSC培养液中加入伤后24 h水疱液;水疱液3组:MSC培养液中加入伤后48 h水疱液;对照组:常规培养.各组所加水疱液体积分数均为20%.观察水疱液微生物生长情况及各组MSC生长情况.流式细胞仪检测培养8 d时各组MSC中CD44、细胞角蛋白7(CK7)阳性表达率.结果 15个水疱液标本细菌、真菌培养均为阴性;各组MSC细胞形态无明显变化,但各水疱液组细胞数量均少于对照组,水疱液3组细胞数量下降明显.水疱液1、2、3组CD44阳性表达率分别为(83.0±3.1)%、(77.2±2.9)%、(65.1±2.3)%,均低于对照组[(89.5±3.2)%,P<0.01];水疱液1、2、3组CK7阳性表达率分别为(24.06±0.11)%、(16.41±0.09)%、(4.48±0.07)%,明显高于对照组[(3.87±0.04)%,P<0.01].结论 烧伤创面水疱液对MSC体外培养有明显的抑制作用,并具有一定的促进MSC表型转化作用.
-
全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉VSMC表型变化及增殖的影响
①目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮后血管平滑肌细胞(VSMC)表型变化及增殖的影响.②方法雄性SD大鼠54只,随机分为3组.ATRA治疗组(n=24)行球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮术,术前4 d开始予ATRA芝麻油混悬液(30 mg·kg-1·d-1)灌胃至术后处死;手术组(n=24)行球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮术,术前4 d开始予芝麻油(1 mL·kg-1·d-1)灌胃至术后处死;对照组(n=6)除不插入球囊导管外,其他操作同手术组.分别于术后2、7、14、28 d取胸主动脉应用苏木精-伊红染色、免疫组化和计算机图像分析法进行形态学、平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actin)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平检测.③结果正常动脉VSMC高表达SM-α-actin,处于非增殖状态;损伤后中膜SM-α-actin表达迅速下降,2 d达低水平,而增殖旺盛,后趋向正常水平;新生内膜在术后7 d出现,处于高度增殖状态,SM-α-actin含量少,术后14、28 d的SM-α-actin表达明显增多,而增殖下降.ATRA治疗能明显抑制中膜SM-α-actin的下调,诱导内膜和中膜SM-α-actin表达,显著抑制VSMC的迁移和增殖,明显抑制新生内膜形成和管腔缩窄.SM-α-actin表达与PCNA表达呈显著负相关(r=-0.738,P<0.01).④结论维持并诱导VSMC于较高的分化状态,抑制VSMC迁移和增殖,是ATRA抑制球囊损伤大鼠主动脉后新生内膜增生和管腔狭窄的可能机制之一.
-
大鼠肾小球硬化中肾小球固有细胞表型转化的研究
目的:观察大鼠肾小球硬化过程中,肾小球内固有细胞的表型转化情况及特征.方法:SD大鼠,单侧肾切除术后1周,阿霉素尾静脉注射5mg/kg建立大鼠肾小球硬化模型.8周末处死大鼠,采用光镜、电镜及免疫组化染色的方法,观察肾组织病理变化及肾小球内固有细胞的表型转化情况.结果:肾小球硬化模型组大鼠肾组织出现肾小球毛细血管管腔狭窄甚至完全闭塞,系膜区增宽,肾小球弥漫性硬化,球囊粘连;电镜下肾小球系膜细胞增殖,细胞外基质增多,基底膜不规则增厚,脏层上皮细胞足突消失,广泛融合成板状;免疫组化染色结果显示,硬化肾小球内系膜区、球囊粘连处、硬化的肾小球周围出现α-平滑肌肌动蛋白强阳性表达.结论 :在大鼠肾小球硬化的发生过程中,肾小球内系膜细胞、脏层上皮细胞均发生了表型转化,并参与促进肾小球硬化的进程.
