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大鼠平滑肌细胞和平滑肌祖细胞的体外培养及二者间表型转化的初步研究
目的 探讨体外分离培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)和平滑肌祖细胞(SPC)的方法,并初步比较不同培养条件下大鼠SPC对VSMC表型转化的影响.方法 原代培养细胞,通过蛋白印迹实验(Western Blot)检测平滑肌α-肌动蛋白(α-SMA)鉴定VSMC,SPC培养后经流式细胞术鉴定分选贴壁细胞CD14和CD105双阳性表达细胞继续培养为SPC,通过SPC与VSMC共培养以及利用Transwell装置条件培养、空白对照3种条件干预后,应用Western Blot法分别测定三组骨桥蛋白水平变化,以检测并初步比较不同条件下SPC对VSMC表型转化的影响.结果 两种细胞分别原代培养后,Western Blot鉴定VSMC,结果显示α-SMA表达呈阳性；鉴定SPC免疫细胞化学染色α-SMA表达呈阳性,且流式细胞仪分析显示CD14和CD105呈双阳性表达.与空白对照相比,两种细胞共同培养和条件培养时VSMC表达骨桥蛋白水平明显升高,共同培养较条件培养骨桥蛋白水平升高效果更为明显.结论 SPC对VSMC的表型由收缩型向合成型转变具有一定作用,SPC通过直接作用与旁分泌作用不同程度地增强了VSMC的表型转化；对比发现,两细胞直接接触培养时VSMC表型转化的影响更为明显(P＜0.05).
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急性脊髓损伤小鼠体内循环平滑肌祖细胞升高
目的 建立两种检测外周血平滑肌祖细胞(SMPCs)的绝对计数方法,评估了方法的观察者内和观察者间差异及初步应用.方法 小鼠眼眶取血样本经抗体孵育后使用“裂解/一次洗涤法”处理,流式细胞仪检测.SMPCs定义为c-kit阴性/CD140b阳性/lineage阴性/sca-1阳性.SMPCs计算方法包括“微球法”和“流式直接体积法”.分别在采血后0、24和48 h后进行检测.SCI模型使用Allen's打击装置造模,检测伤后24 h的SMPCs.结果 微球法和直接体积法的观察者内可靠系数分别是0.947和0.839;观察者间可靠系数分别是0.911和0.768.SMPCs在血液样本中不稳定,静置24和48 h后丢失较多.SCI后24h,SMPCs的数量较正常组和假手术组明显升高.结论 建立了两种SMPCs绝对计数法,有较好的观察者内一致性和观察者间一致性.应用两种方法能够有效的检测到小鼠SCI后SMPCs的升高,为探讨其变化的意义提供了方法和依据.
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大鼠骨髓来源的平滑肌祖细胞培养及鉴定
目的 培养和鉴定从鼠骨髓中分离的平滑肌祖细胞,观察其在体外增殖、分化过程中相关细胞表型的变化.方法 用密度梯度离心法获得鼠骨髓单个核细胞,用条件培养基进行诱导分化,免疫荧光双标技术(α-SMA、CD14)鉴定平滑肌祖细胞(SPC).Western blot检测α-SMA蛋白,Real-time PCR法检测α-SMA mRNA表达.结果 鼠骨髓单个核细胞诱导培养4 d时开始贴壁,7 d变为梭形,14 d呈典型的"峰""谷"样形态;4 d时开始出现α-SMA-CD14双荧光阳性细胞;培养1 d时无α-SMA蛋白表达,4 d后增强,10～14 d达高峰,21 d仍持续高水平;培养1 d的细胞α-SMA mRNA表达低(P<0.01),4 d后增强,14 d达高峰(P<0.01),21 d后仍持续高水平.结论 本试验成功地从鼠骨髓单个核细胞中分离培养出SPC,并在体外扩增分化成平滑肌样细胞.
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平滑肌祖细胞研究进展
平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cells,SPCs)是在体内外能直接分化为血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的前体细胞.近年来有关出生后新生血管形成(neovascu-hrization)的研究发现,SPCs可能存在于成体的骨髓、循环血液和动脉外膜,以及心脏、骨骼肌等外周组织中,并且参与新生内膜形成和动脉粥样硬化的发生与发展.本文就SPCs在成体的起源与分布及其可能的分化与整合机制,以及在血管疾病中的病理生理意义等研究进展作一综述.
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辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞p27蛋白表达的不同影响
目的：观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞（SPC）和内皮祖细胞（EPC）p27蛋白表达的影响，筛选新一代包被洗脱支架药物。
方法：采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞，将其接种在纤维连接素包被培养板，加入不同浓度辛伐他汀（0.01~10μmol/L）培养24 h后，平滑肌肌动脉蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC，激光共聚焦显微镜鉴定FITC结合的植物凝集素（FITC-UEA-Ⅰ）和DiI结合的乙酰化低密度脂蛋白（Di I-acLDL）双染阳性细胞为正在分化的EPC， Western blot检测p27蛋白的表达。 -
平滑肌祖细胞在新型细胞外基质支架上的生长特性
背景:血管壁细胞包括内皮细胞和平滑肌细胞,平滑肌细胞合成分泌的胶原蛋白、弹力蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质是提供血管塑形及张力的主要成分,平滑肌细胞在细胞外基质支架上生长可能更接近体内生长环境特性.目的:观察鼠骨髓来源平滑肌祖细胞在毯状细胞外基质支架上的生长特性.设计、时间及地点:细胞水平对比观察实验,于2007-07/2008-07在江苏大学临床检验实验室完成.材料:将纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝coagulation作用下,构建毯状细胞外基质支架.方法:实验组诱导培养骨髓来源的第2代平滑肌祖细胞种植在毯状细胞外基质支架表面.对照组将骨髓来源的第2代平滑肌祖细胞接种到无菌圆盖玻片上.主要观察指标:于培养1,4,7,10,14,21 d用电镜观察支架表面结构及平滑肌祖细胞生长情况;Westem Blotting法、Real-Time PCR法分别检测α-SMA蛋白及mRNA表达变化.结果:实验组平滑肌祖细胞贴壁率、增殖数明显高于对照组(P＜0.01);电镜显示细胞在支架表面形成较平整的平面,如典型"平滑肌"形状:实验组平滑肌祖细胞为多层、三维立体、更接近天然血管的结构;实验组α-SMA蛋白及基因表达明显高于对照组(P＜0.05).结论:细胞外基质支架能显著促进平滑肌祖细胞黏附、增殖和分化,可作为一种新颖的合成人造血管的生物组织工程支架.
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成人外周血平滑肌祖细胞的体外培养
背景:外周血平滑肌祖细胞具有向平滑肌细胞分化的能力.目的:探索体外分离培养成人外周血平滑肌祖细胞的方法及其生长分化特性.方法:采用密度梯度离心法分离获得成人外周血单个核细胞,培养12 d后,应用流式细胞仪鉴定分析平滑肌祖细胞并分选纯化,继续培养诱导分化.采用倒置显微镜观察平滑肌祖细胞的形态变化,免疫荧光染色法观察其α-肌动蛋白的表达,同时应用Western blot法检测调宁蛋白、平滑肌肌球蛋白重链的表达情况.此外,观察平滑肌祖细胞的生长特性,绘制生长曲线.结果与结论:成人外周血单个核细胞诱导培养4 d时开始出现细胞集落,12 d时细胞呈明显梭形.流式细胞仪分析显示,CD14和CD105双阳性的平滑肌祖细胞占贴壁细胞的(71.8±7.2)%.分选纯化的平滑肌祖细胞培养到28 d呈旋涡状生长.间接免疫荧光染色显示,α-肌动蛋白表达呈阳性.Western blot检测显示,调宁蛋白和平滑肌肌球蛋白重链分别于14,21 d开始表达,并逐渐增加.生长曲线表明,细胞生长至第6天进入对数生长期,第12天后进入平台期.提示通过对外周血单个核细胞的诱导培养,可以获得大量的平滑肌祖细胞.它能稳定增殖,并可进一步分化为平滑肌细胞.
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骨髓间质细胞中组织定向干细胞的鉴定
目的:验证骨髓中存在组织定向干细胞(TCSCs),为心血管组织工程提供理想的种子细胞来源.方法:采用SDF-1α梯度趋化从骨髓中分离CXCR4阳性细胞,免疫细胞化学法检测CXCR4与PDGFR-β表达,流试细胞仪检测PDGFR-β阳性细胞,从而确定平滑肌祖细胞(SMPCs)的比例;从骨髓分离培养内皮祖细胞(EPCs),免疫细胞化学和流式细胞仪检测FLK-1、CD34、CXCR4与vWF的表达情况.结果:SDF-1α趋化分离出细胞几乎都为CXR4阳性,其中4.67%的细胞呈PDGFR-β阳性;EPCs形态圆形或近三角形贴壁生长,原代细胞CXCR4、VEGFR-2、CD34明显阳性,传代细胞vWF阳性.结论:在骨髓基质细胞中存在SMPCs和EPCs等TCSCs.
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血管平滑肌祖细胞与血管疾病
体内和体外实验证实,外周血单个核细胞能向平滑肌细胞分化,同时还带有干细胞的标记,因此人们提出了平滑肌祖细胞的概念.大量实验证实不同来源的平滑肌祖细胞参与了血管病变的形成过程.本文综述了平滑肌祖细胞的一般特性以及其与动脉粥样硬化和血管机械损伤等血管疾病之间的关系.
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辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞分化的不同影响
目的:观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞(SPC)和内皮祖细胞(EPC)分化的影响.方法:采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,将其接种在纤维连接素包被培养板,加入不同浓度辛伐他汀(0.01～10μmol/L)培养8 d.采用平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和Di I-acLDL双染阳性细胞为正在分化的EPC,并在倒置荧光显微镜下计数.结果:辛伐他汀显著抑制骨髓单个核细胞分化为SPC.0.01μmol/L辛伐他汀组与对照组SPC数量分别为79±5对85±4(P<0.05).辛伐他汀显著促进骨髓单个核细胞向EPC分化,其促进作用随辛伐他汀浓度升高而增加,在1.0 μmol/L达大效应.1 μmol/L辛伐他汀组与对照组EPC数量分别为87±5对39±4(P<0.01).结论:辛伐他汀选择性抑制骨髓单个核细胞向SPC分化,促进其向EPC分化,局部应用有促进损伤血管再内皮化和抑制新生内膜过度增生的可能.
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同步诱导培养兔骨髓源性内皮祖细胞和平滑肌祖细胞
目的 采用兔骨髓来源的单个核细胞同步诱导分化为兔内皮祖细胞(EPCs)和平滑肌祖细胞(SPCs),研究其生物学特性,评估其作为组织工程化静脉瓣种子细胞的可能性.方法 梯度密度离心法获取兔骨髓血单个核细胞沉淀,分别用含5％胎牛血清(FBS)的EGM-2完全培养液向EPCs方向诱导培养;用含20 ng/mL血小板源性生长因子BB、5％FBS,不含血管内皮生长因子(VEGF)的EBM-2培养液向SPCs方向诱导培养.鉴定两种细胞的分化情况.结果 诱导的EPCs培养至10 d左右,细胞单层融合呈“铺路石”状;表达血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)、血管性血友病因子(vWF)、CD133,不表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);透射电镜可见细胞质内特征性Weibel-Palade小体;细胞生物学功能检测可见EPCs在基质胶上呈现血管状生长.诱导的SPCs培养至14d左右呈现血管平滑肌细胞“峰-谷”样生长特性;表达CD34、α-SMA,不表达vWF和VEGFR-2;在透射电镜下可见细胞内含有与细胞纵轴平行排列的肌丝;在基质胶上不规则生长.结论 兔骨髓血梯度密度离心得到的单个核细胞可同步诱导分化为EPCs和SPCs,为构建组织工程化静脉瓣提供了经济且可简便获取的种子细胞.
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骨髓单个核细胞构建细胞化生物组织工程血管支架的研究
目的 研究鼠骨髓来源平滑肌祖细胞(SPCs)和内皮祖细胞(EPCs)在细胞外基质支架上的生长特性,为生物组织工程血管寻找更新的种子细胞和支架.方法 将鼠骨髓来源单个核细胞(BMCs)分别用不同的培养基进行诱导分化,于培养10 d后用免疫荧光双标技术(CD34/VWF)鉴定EPCs,用α-SMA/CD14鉴定SPC.将纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝作用下,构建毯状细胞外基质(ECM)支架,在支架表面种植诱导培养骨髓来源的第2代SPCs和EPCs.用扫描电镜和透射电镜观察和分析的支架表面结构以及细胞在支架上生长情况.结果 单个核细胞经EBM-2培养基诱导,培养至10 d双荧光染色结果 表明,培养贴壁细胞中约90%的EPCs呈VWF/CD34双阳性;经bFGF的M-199培养基诱导阳性率逐渐增加,培养至10 d双荧光染色结果 表明,培养贴壁细胞中SPCs呈α-SMA/CD14双标阳性100%.将诱导培养的第2代SPCs,种植在支架上,4 d时倒置显微镜示SPCs在支架表面细胞融合呈现典型的"峰"、"谷"样形态,当EPCs被种植10 d时扫描电镜显示在支架表面形成一个完整的较平整的细胞平面.透射电镜发现在多层平滑肌祖细胞表面有单层内皮祖细胞,呈三维立体结构,具有天然血管的内膜和中膜,更接近天然血管的结构.结论 BMCs将是组织工程血管理想的细胞来源,细胞外基质支架能显著促进SPCs和EPCs粘附、增殖和分化,可作为SPCs和EPCs生长的载体,可作为一种新颖的合成人造血管的生物组织工程支架.
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小鼠平滑肌祖细胞培养及其体内外迁移功能的研究
目的：建立一种有效的小鼠平滑肌祖细胞的培养方法，并对其迁移功能进行研究。方法使用C57 BL／6小鼠制备密质骨来源间充干细胞， PDGF-BB诱导其分化并采用形态学观察、免疫细胞化学染色及流式分析的方法进行鉴定。使用Transwell小室及流式分析方法检测其迁移能力。结果 PDGF-BB诱导7 d后，镜下可见细胞呈长梭型，免疫细胞化学染色显示开始表达α-SMA。诱导21 d后，流式分析证实70％以上的细胞表达CD34＋／α-SMA＋双阳性，58.5％细胞开始表达SM-MHC。迁移实验表明，培养得到的平滑肌祖细胞在体内外均具有良好的迁移能力。结论通过使用密质骨来源间充干细胞制备平滑肌祖细胞具有操作简便、获取率高及培养周期短等优点，培养得到的平滑肌祖细胞在体内外均具有迁移能力，适于进行后续功能及机制研究。
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氧化型低密度脂蛋白对平滑肌祖细胞增殖和表型的影响
目的 研究氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌祖细胞生物学性状的影响.方法 分离人外周血单个核细胞,用纤粘连蛋白、血小板源性生长因子BB和EGM培养基诱导培养出平滑肌祖细胞,用细胞免疫荧光法和逆转录-聚合酶链反应法鉴定.用分别含终浓度为25、50、100、200 mg/L氧化型低密度脂蛋白的培养基培养平滑肌祖细胞24 h,然后用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖能力,用细胞免疫荧光法和逆转录-聚合酶链反应法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达.结果 平滑肌祖细胞呈"峰、谷"样生长,可表达α-平滑肌肌动蛋白和调宁蛋白.4种不同浓度氧化型低密度脂蛋白组细胞增殖能力均高于对照组(P<0.05),当氧化型低密度脂蛋白为50 mg/L时细胞增殖能力强,氧化型低密度脂蛋白组细胞内α-平滑肌肌动蛋白的表达明显弱于对照组.结论 氧化型低密度脂蛋白可以促进血管平滑肌祖细胞的增殖并减弱其α-平滑肌肌动蛋白的表达.
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雷帕霉素对大鼠骨髓源平滑肌祖细胞增殖及分化的影响
目的 观察雷帕霉素对骨髓源性平滑肌祖细胞增殖及分化的影响,探讨影响动脉粥样硬化的骨髓源性平滑肌祖细胞与雷帕霉素洗脱支架抑制新内膜增生的关系.方法 采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞,接种于纤维连接素包被的培养板,加入不同浓度雷帕霉素(0.01～100 μg/L),培养12天后,α-SMA免疫荧光染色鉴定骨髓源性平滑肌祖细胞,并在倒置荧光显微镜下计数.收集培养8天贴壁细胞,分别加入不同浓度雷帕霉素(0.1～200 μg/L)培养24 h.分别采用MTT 比色法、改良的Boyden 小室和粘附能力测定实验观察平滑肌祖细胞的增殖、迁移和粘附能力.结果 雷帕霉素显著抑制骨髓单个核细胞分化为平滑肌祖细胞,0.1 μg/L雷帕霉素作用12天,平滑肌祖细胞减少了70.9%±4.5% (P＜0.01).雷帕霉素也显著抑制平滑肌祖细胞增殖,其抑制作用随雷帕霉素浓度增加而增加,1 μg/L雷帕霉素作用24 h使平滑肌祖细胞数量减少27.1%±4.5%(P＜0.01).0.1～200 μg/L雷帕霉素显著抑制平滑肌祖细胞的粘附和迁移能力.结论 雷帕霉素可抑制平滑肌祖细胞分化,并抑制平滑肌祖细胞增殖及迁移能力.
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心肌素在平滑肌细胞分化及表型调节中的作用
平滑肌细胞在动脉粥样硬化的发生和进展过程中起了重要作用.粥样斑块中的平滑肌细胞不仅来源于中膜平滑肌,还可以从骨髓干细胞分化而来.平滑肌细胞的分化是高度可逆的,并在多种局部环境因素的参与作用下发育.平滑肌细胞表达多种标志表明它们在分化成熟中的相对状态.但是没有单个细胞分化特异性标志能将平滑肌细胞与其它完全区别开.心肌素及与其相关的血浆反应因子共刺激因子、ETS家族三元复合物(EIK-1)和心肌素相关转录因子对平滑肌细胞分化起到一定作用.因此平滑肌祖细胞概念的提出,为动脉粥样硬化防治提供了一种新的治疗策略.
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干细胞/组细胞与动脉粥样硬化研究进展
动脉粥样硬化及其相关并发症是人类死亡的主要原因.与其他危险因素相比,越来越多学者认为衰老是动脉粥样硬化的主要危险因素.60岁以上,年龄将支配风险预测中所有其他风险因素.然而老龄化风险的具体机制尚不清楚.近年来,干细胞/祖细胞与疾病的相关性研究突飞猛进,血管祖细胞与血管性疾病的关系日益受到人们的关注.1997年Asahara首次报道了在循环血液中有争议的内皮祖细胞的分离.这些细胞能够在体外分化为成熟的内皮细胞,并结合于血管生成的活性位点.这一发现开创了血管生物学的新时代,也使研究者们对动脉粥样硬化及血栓栓塞等并发症开始重新认识.提出了动脉粥样硬化风险的一个新的概念:在动脉粥样硬化的发展过程中,存在修复损伤内皮的内皮祖细胞耗竭,即内皮祖细胞依赖性的动脉修复缺乏.平滑肌祖细胞则是斑块内平滑肌源性泡沫细胞的重要来源之一,参与了斑块的形成.本文重点阐述动脉粥样硬化发生发展中干细胞/组细胞的作用.尤其是内皮祖细胞、平滑肌祖细胞与动脉粥样硬化的关系及血管祖细胞的分化等问题.
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辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞P27蛋白表达的不同影响
目的 观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cell,SPC)和内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC) p27蛋白表达的影响,筛选新一代包被洗脱支架药物.方法 采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞,将其接种在纤维连接素包被培养板,加入不同浓度辛伐他汀(0.01～10 μmol/L)培养24 h后,平滑肌肌动脉蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,激光共聚焦显微镜鉴定异硫氰酸荧光素(FITC)结合的植物凝集素(FITC-UEA-I)和DiI结合的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)双染阳性细胞为正在分化的EPC,Western blot检测p27蛋白的表达.结果 辛伐他汀浓度依赖性促进SPC细胞p27表达,0.1 μmol/L辛伐他汀即可上调p27表达(n=5,P＜0.01).与SPC相反,辛伐他汀浓度依赖性抑制EPC细胞p27表达,0.01 μmol/L辛伐他汀即可下调p27表达(n=5,P＜0.01).结论 辛伐他汀选择性上调SPC的p27表达,下调EPC的p27表达,局部应用有抑制再狭窄和促进损伤血管再内皮化可能.
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高糖对成人外周血平滑肌祖细胞功能的影响
目的 观察不同浓度葡萄糖对体外培养成人外周血平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cells，SPCs)增殖、迁移和黏附能力的影响。方法 采用密度梯度离心法从健康成人外周血获取单个核细胞，培养12 d后,采用流式细胞仪对诱导扩增的SPCs进行分析鉴定并分选纯化。间接免疫荧光染色法观察SPCs培养到第28天后人平滑肌细胞特异性肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。收集培养第12天的SPCs，随机(补充具体的随机方法?)分为5组并给予不同浓度葡萄糖干预：对照组(5.5 mmol/L)，11mmol/L组，22 mmol/L组，44mmol/L组和渗透压对照组(5.5 mmol/L葡萄糖加38 mmol/L甘露醇)。分别用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法，Transwell小室迁移实验以及黏附能力测定实验检测各组干预6 d后SPCs增殖、迁移和黏附能力的变化。此外，培养SPCs 8 d，期间用22 mmol/L葡萄糖分别干预0、2、4、8 d，观察各组细胞增殖、迁移和黏附能力的变化。结果 与对照组相比，高糖各组均能明显促进外周血SPCs的增殖、迁移和黏附能力，其中22 mmol/L葡萄糖组的影响为显著，44mmol/L葡萄糖组的促进作用有所下降。用22 mmol/L葡萄糖分别干预SPCs 0、2、4、8 d，其增殖、迁移和黏附能力随着作用时间延长而增强，以干预8 d组显著。结论 高糖能在一定范围内增强外周血SPCs的增殖、迁移、黏附能力，随着浓度增加和时间延长，作用更明显。推测长期高血糖通过促进SPCs的功能参与受损血管过度修复，引起部分心血管疾病的发生发展。
