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EGCG治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎免疫学作用机制研究
为了探讨表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG)治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠的免疫学作用机制.通过用MOG35-55肽段免疫小鼠建立EAE疾病模型,分别获取EGCG治疗组及对照组小鼠体内MOG35-55特异性T细胞,3H掺入法检测EGCG对其增殖的影响;ELISA方法检测培养上清中IFN-γ、IL-4及TNF-α的含量;Western blot方法检测NF-κB信号通路中IKK和IκB蛋白表达水平;定量PCR技术检测Th1和Th2细胞转录因子T-bet及GATA-3基因表达水平.结果显示:EGCG治疗明显抑制MOG特异性T细胞的增殖;抑制炎性细胞因子IFN-γ及TNF-α的表达,并增加IL-4的表达水平;抑制NF-κB信号通路中IKK蛋白的表达;调节Th1/Th2细胞分化过程中特异性转录因子T-bet及GATA-3基因表达水平.研究结果表明,EGCG通过抑制MOG特异性T细胞增殖,抑制IKK蛋白表达,促使Th1型细胞向Th2型细胞转化等途径治疗EAE,为今后临床研究治疗多发性硬化症药物提供实验基础.
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实验性自身免疫性脑脊髓炎神经细胞内钙离子的变化及其意义
目的探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)发病初期及高峰期活体脑片内Ca2+荧光强度的变化,明确神经细胞内Ca2+的变化与病情演变的关系.方法采用激光共聚焦扫描显微镜(1aser scanconfocal microscope,LSCM)对荧光探剂fluo-3/AM负载的活体脑片进行观察,比较EAE发病初期组、高峰期组及正常对照组小鼠脑片的皮层、实质区域Ca2+的相对荧光强度.结果EAE发病初期组及空白对照组小鼠大脑皮层的Ca2+荧光强度均明显高于脑实质部位(P＜0.05)、EAE高峰期组大脑皮层及脑内局灶区域的Ca2+相对荧光强度高于EAE初发病组(P＜0.05).结论EAE小鼠大脑皮层及脑内局灶区域均存在着神经细胞内的Ca2+内流,这种改变随着EAE病情的进展而增强.
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山茱萸新苷对EAE中枢神经系统MCP-1表达及CD68阳性细胞浸润的影响
[目的]研究山茱萸新苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎（ experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）大鼠中枢神经系统单核细胞趋化蛋白-1（ monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）表达及CD68阳性细胞浸润的影响。[方法]制备豚鼠全脊髓匀浆免疫抗原，皮下注射至 Lewis大鼠，建立EAE模型。设正常对照组、EAE组、山茱萸新苷组、波尼松组，每天神经功能评分，待症状达到高峰处死实验动物，用RT-PCR、Western Blot法比较各组实验动物中枢神经系统MCP-1 mRNA及蛋白的表达，免疫组织化学染色法比较各组实验动物中枢神经系统 CD68阳性细胞浸润情况。[结果]正常对照组、EAE组、山茱萸新苷组、波尼松组大鼠MCP-1 mRNA的相对表达量分别为（11.265±2.928）、（401.373±55.398）、（124.987±20.244）、（75.465±7.766），MCP-1蛋白相对表达量分别为（7.458±2.570）、（24.155±1.420）、（19.568±0.863）、（17.458±1.630），CD68阳性指数分别为0%、（41.93±12.25）%、（16.08±8.70）%、（5.38±2.88）%。使用单因素方差分析法，MCP-1 mRNA的相对表达量、MCP-1蛋白相对表达量、CD68阳性指数组间差异显著，均有统计学意义（ F=199.734、66.081、35.565，均P=0.000）。山茱萸新苷组与EAE组在神经功能评分、MCP-1 mRNA的相对表达量、MCP-1蛋白相对表达量、CD68阳性指数表达差异均有统计学意义（ P=0.002、0.000、0.003、0.013）。[结论]山茱萸新苷可改善 EAE大鼠神经功能，抑制EAE大鼠中枢神经系统MCP-1表达及CD68阳性细胞浸润。
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多重PCR快速鉴定大肠杆菌O157
目的 根据GenBank中编码大肠杆菌16S rRNA的基因、rfbE(O157抗原基因)、vt1(Vero毒素1基因)、vt2(Vero毒素2基因)和eaeA(紧密素基因)5种基因的特异性序列,设计合成5对引物,建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法.该方法的检测敏感度为细菌纯培养物为104CFU/ml,含菌3-4CFU/g鸡肉组织样品经预增菌8h后能检出.用此方法检测2000-2004年间从动物组织和粪便中临床分离的64株菌株,结果10株鉴定为大肠杆菌O157,与血清凝集试验结果完全吻合.其中8株能扩增上述5条特异性条带,与预期产物完全一致,2株能扩增出除vt1基因外的4条特异性条带,其它54株菌株只能扩增出大肠杆菌16S rRNA.该方法能直接鉴定产多种毒力因子的大肠杆菌O157,特异性强,为检测和鉴定大肠杆菌O157提供了一个新方法.
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四川自贡地区健康人群中艾伯特埃希菌的分离鉴定
目的 了解长期从事鸡鸭等家禽养殖及屠宰人员等健康人群艾伯特埃希菌的携带情况.方法 收集家禽养殖、屠宰人群及其他健康人粪便,经EC肉汤增菌后PCR检测eae基因,阳性样品接种麦康凯琼脂,挑选不发酵乳糖菌落,通过16S rDNA序列分析和多位点序列分型(MLST)对菌株进行鉴定.分离株进行紧密粘附素亚型和cdtB亚型分析,并通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析与动物来源艾伯特埃希菌菌株间的相关性.结果 从189份从事鸡鸭宰杀人员的粪便中,分离到2株艾伯特埃希菌,从58份其他健康人群粪便中分离到1株菌,而138份家禽养殖场人员粪便中未分离到菌株.3株菌株的紧密粘附素亚型分别为sigma,iota 2,nu,cdtB亚型均为II/ⅢI/Ⅴ亚型.PFGE显示三株菌之间的带型相似性小于80％,并且与鸡鸭等来源的艾伯特埃希菌带型不同.结论 从事鸡鸭屠宰等健康人员中存在一定程度的艾伯特埃希菌携带率,但其与家禽携带艾伯特埃希菌的关系,仍需进一步研究.
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依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的保护作用
目的 观察依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的保护作用.方法 将40只健康成年Wistar大鼠随机分成正常组、EAE组、LDE组、HDE组各10只,EAE组、LDE组、HDE组建立EAE模型,LDE组、HDE组分别腹腔注射相应剂量的药物.正常组、EAE组仅腹腔注射生理盐水0.5ml/d,所有大鼠24h后处死.结果 EAE组神经功能缺损评分＞LDE组＞HDE组,组间比较有显著性差异(P＜0.05)；EAE组iNOS、OPN阳性细胞表达＞LDE组＞HDE组,组间比较有显著性差异(P＜0.05).结论 依达拉奉对EAE的保护作用可能与其清除自由基、减轻炎症反应、减少iNOS和OPN表达有关.
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异体骨髓间充质干细胞对 EAE 大鼠神经再生保护作用的研究
目的：观察异体骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植后在EAE大鼠体内存活、增殖、分化，探讨BMSCs对EAE的神经再生的修复作用及迁徙分化情况。方法 SD雌性大鼠45只，随机分为3组，其中EAE模型组20只，正常对照组5只， EAE模型BMSCs移植组20只。重组免疫蛋白MBP68‐86诱导建立EAE的动物模型，在免疫后早期第5天静脉输注Wistar大鼠的BMSCs（4×106／只，0.4 mL）。观察输注后大鼠神经功能变化和组织学变化，利用免疫组化方法检测不同时间脑脊髓神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、2’，3’‐环腺苷酸‐3’‐磷酸二酯酶（CNPase）表达，观察BMSCs移植后EAE大鼠体内神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞数量。结果 EAE大鼠免疫后早期移植BMSCs ，神经功能评分无论是高峰期评分还是平均评分显著低于EAE模型组。BMSCs移植组在第7天NSE阳性细胞数较EAE模型组表达水平增多，但并无显著性差异，而第15天、第21天和第30天NSE阳性细胞数明显高于EAE模型组的表达水平（P＜0.05）。BMSCs移植组各时间点CNPase染色阳性细胞数明显高于EAE模型组的表达水平（P＜0.05），随着时间迁移，BMSCs移植组CNPase染色阳性细胞数表达逐渐增加。BMSCs移植组各个时间点GFAP阳性细胞数与EAE模型组比较无显著性差异。病理检查显示EAE大鼠免疫后早期移植BMSCs可使脑组织炎症反应减轻，脱髓鞘病灶的数目也明显少于EAE模型组。结论预防性静脉输注BM SCs可能通过免疫调节，抑制免疫反应所致的神经细胞损伤，减少神经元和少突胶质细胞的凋亡，从而发挥神经保护作用，但不能排除仍有部分BMSCs在局部微环境信号的诱导下向脱髓鞘区迁徙并分化为髓鞘形成细胞的可能。
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骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的效果及免疫调节机制
目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗作用及相关免疫调节机制.方法:分离纯化培养BMSCs建立EAE动物模型,随机分为CFA组、BMSCs回输CFA组、MBP组及BMSCs回输MBP组.BMSCs回输CFA组和BMSCs回输MBP组于免疫后第6天尾静脉回输BMSCs,发病高峰期取材,全部大鼠予临床评价,检测淋巴细胞和IL-17+细胞浸润及T淋巴细胞增殖情况.建立BMSCs与淋巴细胞的共培养体系,观察BMSCs在封闭IL-27后对T淋巴细胞中Th17的影响.用ELISA检测大鼠血清或细胞培养上清中相关细胞因子表达.结果:BMSCs回输MBP组与MBP组相比,发病率降低,发病时间延后,临床评分显著降低(P＜0. 05),炎性细胞浸润明显减轻(P＜0. 01),IL-17+T细胞表达显著减少(P＜0. 01),血清中IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-23表达水平降低(P＜0. 05),IL-4、TGF-β和IL-27表达水平升高(P＜0. 05).IL-27中和的BMSCs与病理性T细胞共培养后,细胞培养上清中TNF-α、IFNγ和IL-23的分泌水平明显升高(P＜0. 05),IL-4的分泌水平降低(P＜0. 01),IL-17的分泌水平显著升高(P＜0. 01).结论:BMSCs经静脉移植治疗可以降低EAE发病程度,其作用机制是通过降低T淋巴细胞的反应性,通过IL-27的信号传导通路抑制EAE的靶细胞Th17产生生物学效应的.
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雷公藤内脂醇对EAE大鼠MCP-1 mRNA表达的影响
目的探讨雷公藤内脂醇(TRD)对EAE大鼠MCP-1 mRNA表达的影响.方法将Wistar大鼠免疫后7 d随机分成4组:EAE组、TRD 1组、TRD 2组、TRD 3组,给予不同剂量的药物注射,取脑和脊髓制成石蜡切片,进行HE和MCP-1 mRNA的原位杂交染色,比较各项临床指标.结果TRD在每只鼠每日40μg剂量下影响EAE大鼠MCP-1 mRNA的表达.结论雷公藤内脂醇可增加循环中的糖皮质激素从而抑制EAE中MCP-1mRNA的表达,抑制EAE.
关键词： 雷公藤内脂醇(TRD) EAE MCP-1 mRNA -
肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究
目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.
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新型Rho激酶抑制剂FSD-C11对EAE的免疫调节作用
目的 探讨Rho激酶抑制剂Fasudil衍生物FSD-C 11治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的免疫调节机制.方法 采用MOG35-55多肽建立C57BL/6小鼠EAE模型,随机分为FSD-C11组和Saline组,于免疫后第3天起腹腔注射FSD-C11化合物和Saline.免疫后28 d处死小鼠,FACS法检测脾组织CD4+T细胞亚群,ELISA法检测外周免疫系统中细胞因子的分泌情况,Westemblot法测定脊髓ROCKⅡ、iNOS、Arg-1、TLR-2和TLR-4的蛋白表达.结果FSD-C11干预EAE能够抑制脊髓中ROCKⅡ表达,减少外周CD4+IFN-y+T细胞,增加CD4+IL-10+和CD4+CD25+T细胞(P＜0.05),减少外周免疫系统炎性细胞因子IFN-y、IL-17、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量(P＜0.05),而增加IL-10的含量(P＜0.05),抑制脊髓组织中巨噬细胞标志蛋白iNOS表达、增加Arg-1的表达(P＜0.05).抑制脊髓组织中TLR-2和TLR-4蛋白表达(P＜0.05).结论FSD-C 11可调节外周免疫细胞活化和增殖,抑制外周免疫系统分泌炎性因子,增加保护性的细胞因子,改善炎性微环境,促进M1型巨噬细胞向M2型转化,控制CNS的炎性细胞侵润,从而达到减轻或改善EAE的临床症状.
关键词： Fasudil衍生物FSD-C11 EAE 免疫调节 -
B细胞连接蛋白的表达抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎
目的 研究B细胞连接蛋白BLNK(B-cell linker protein)的表达对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)的影响并初步探讨其可能的机制.方法 MOG35-55多肽免疫BLNK缺陷(BLNK-deficient,BLNK-/-)鼠及C57BL/6鼠制备EAE小鼠模型,观察实验动物的临床症状及中枢神经系统的病理学变化;应用ELISA方法检测血清中的MOG特异性IgG和IgM抗体水平;采用流式细胞术检测脾脏中调节性T细胞的变化;分选的脾脏B淋巴细胞采用RT-PCR技术评价B细胞所分泌的细胞因子的变化.结果 BLNK-/-鼠临床症状评分明显高于C57BL/6鼠(P＜0.01);HE染色及LFB染色结果显示,BLNK-/-鼠与C57BL/C鼠比较炎症感染灶及脱髓鞘病灶明显增多.BLNK-/-鼠血清中的MOG特异性IgG和IgM抗体水平显著低于C57BL/C鼠(P＜0.005).BLNK-/-鼠与C57BL/6鼠相比,脾脏中调节性T细胞百分比及B细胞所分泌的IL-10的表达明显减少,而IL-2的表达显著增高(P＜0.05);IFN-γ的表达水平在2组小鼠之间无统计学差异(P＞0.05).结论 BLNK的表达抑制EAE,其机制可能是通过对B细胞分泌的Th 1/Th2细胞因子的调节来实现.
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实验性自身免疫性脑脊髓炎中B7-H1分子在脾脏和中枢神经系统淋巴细胞上的表达变化
[目的]观察实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病高峰期淋巴细胞表面B7-H1分子的表达变化,探讨B7-H1在EAE发病和病情进展中的作用.[方法]以MOG35-55诱导雌性C58BL/6小鼠制备EAE动物模型,并对其行为学变化进行记录与评分.分别于发病前和发病高峰期处死小鼠,分离脾脏与中枢神经系统中的淋巴细胞,用流式细胞术分析淋巴细胞表面B7-H1分子的表达差异.[结果]与发病前相比,EAE发病高峰期脾脏分离的淋巴细胞中B7-H1阳性细胞率由(35.1±2.46)％下降至(18.9±2.06)％(P＜0.01),其中CD4+T细胞中B7-H1阳性细胞由发病前的(6.4±1.25)％下降至发病后的(2.3±1.04)％(P＜0.05).中枢神经系统浸润的淋巴细胞中有8.7％为B7-H1阳性细胞.[结论]在EAE发病过程中,B7-H1分子在外周淋巴细胞的阳性细胞数下降,而中枢神经系统浸润的淋巴细胞中有一定比例的B7-H1阳性细胞,提示B7-H1可能在EAE发病过程中发挥重要作用.
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实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脾脏和肝脏中NKT细胞调变的研究
目的:观察NKT细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脾脏和肝脏中所占百分比的变化特点,探讨NKT细胞在EAE模型中的免疫调节作用.方法:以MOG_(35-55)21肽诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型并进行临床评分.于发病高峰期处死小鼠,分离脾脏和肝脏淋巴细胞,采用免疫荧光染色和流式细胞术(FCM)分析,观察EAE小鼠与正常小鼠脾脏和肝脏中NKT细胞在全部淋巴细胞中所占百分率的变化.结果:在EAE小鼠不同器官中,NKT细胞占淋巴细胞的百分率均较正常小鼠减少.脾脏NKT细胞百分率(%)从正常组2.22±0.14下降到EAE模型组1.94±0.07(P<0.05),肝脏NKT细胞百分率(%)从正常组5.52±2.17下降到2.67±1.41(P<0.05).结论:NKT细胞在EAE模型C57BL/6小鼠脾脏和肝脏中增殖受抑,提示EAE发病可能通过对NKT细胞数量的调节进而影响其对免疫应答的调节.
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银杏叶提取物对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的作用研究
目的:建立雌性Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型,观察银杏叶提取物EGb761腹腔注射对EAE大鼠的可能疗效及神经保护作用和机制.方法:建立Wistar大鼠EAE模型,腹腔注射EGb761(70mg/kg),连续7d,于免疫后第14d和第31d取颈膨大,分别进行HE、LFB和改良BLS染色,观察各组大鼠炎细胞浸润、髓鞘脱失和轴突缺失情况.结果:(1)EGb761组与EAE组相比临床评分明显减低(P＜0.05);(2)HE染色显示:EGb761组炎症浸润与EAE组相比明显减低(P＜0.01);(3)LFB染色显示:EGb761脱髓鞘评分与EAE组相比明显降低(P＜0.05);(4)改良Bielschowsky染色显示:EGb761组高峰期轴突平均缺失而积与EAE组相比明显下降(P＜0.01).结论:EGb761通过减轻炎细胞浸润、促进髓鞘再生和防止轴突缺失,从而对EAE大鼠临床症状的改善起到一定作用.
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TNF-α及IFN-γ在EAE动物模型免疫学发病机理中的作用
目的:探讨TNF-α及IFN-γ在实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)动物模型免疫学发病机理中的作用.方法:建立EAE模型,采用放射免疫分析技术检测EAE模型的TNF-α水平,采用双抗体夹心法酶联免疫吸附实验检测了EAE模型的IFN-γ水平.结果:EAE组的TNF-α及IFN-γ水平均明显高于正常时照组.结论:TNF-α及IFN-γ在EAE免疫学发病机制中具有重要作用,验证了细胞因子(CK)是EAE致病的重要分子基础.为深入研究多发性硬化(MS)的发病机理及探索新的有效治疗途径提供了理论依据.
