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MsrB1对ONOO-诱导的人晶状体上皮细胞周期的影响
目的 探讨蛋氨酸亚砜还原酶B1 (methionine sulfoxide reductase B1,MsrB1)基因沉默对过氧亚硝酸根(ONOO)诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)细胞周期的影响和ERK信号通路在其中的调节作用.方法 将培养的HLEC分为两组:正常组和MsrB1基因沉默组,分别用0μmol·L-1、100 μmol·L-1、200μmol·L-1和300μmol·L-1ONOO-处理20 min后,继续培养12 h用RT-PCR法检测MsrB1基因表达水平变化,流式细胞仪检测细胞周期水平变化,Western blot法检测MsrB1基因沉默和ONOO对pERK表达水平的影响.结果 300 μmol·L-1ONOO-处理HLEC会导致MsrB1表达水平显著下降(P＜0.01),当MsrB1基因沉默细胞经300 μmol·L-1ONOO-处理后,MsrB1表达水平进一步显著下调(P＜0.05).经200μmol·L-1或300 μmol·L-1ONOO-处理,HLEC细胞周期分别阻滞在G2/M期和S期,当MsrB1基因沉默细胞经200μmol·L-1或300μmol·L-1ONOO-处理后,更多的细胞阻滞在G2/M期或S期(P＜0.05) pERK检测结果表明,MsrB1基因沉默前后经ONOO处理导致的细胞周期阻滞和pERK表达水平显著下降有关(P＜0.01).结论 ONOO可以下调HLECMsrB1表达水平,MsrB1基因沉默细胞经ONOO处理,pERK表达水平显著下降,导致更多细胞阻滞在G2/M期和S期.
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非瑟酮对人晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响
目的 研究非瑟酮(fisetin,Fis)在生理状态下及氧化应激状态下对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC)增殖和凋亡的影响.方法 体外培养HLEC,通过H2O2氧化损伤建立氧化应激模型,设置空白对照组、H2O2组、Fis组和Fis+ H2O2组,其中Fis组和Fis+ H2 O2组按Fis浓度(5μg·mL-1、10 μg· mL-1和20 μg·mL-1)分为3个亚组.分别于培养12h及24 h后,倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态学改变,运用MTT法检测细胞增殖的变化,运用流式细胞技术检测细胞凋亡率的变化.结果 与空白对照组比较,H2O2组较多细胞出现典型的形态学改变,细胞增殖能力明显降低(12 h、24 h后分别为0.117 6±0.015 0和0.117 2±0.006 1),凋亡率明显增加(24 h后为12.35％±1.23％),差异均有统计学意义(均为P＜O.01).不同浓度Fis组间的细胞在培养12 h及24 h后细胞形态均无明显改变,细胞增殖也无明显变化(P＞0.05).培养12及24 h后,与H2O2组比较,Fis+H2O2组发生形态改变的细胞减少,细胞增殖能力明显改善,且随时间、Fis浓度增加其作用更明显(高为0.399 4±0.025 7)(P＜0.05).培养24 h后,与H2O,组凋亡率比较,不同浓度Fis+H2O2组的细胞凋亡率逐渐降低,依次为(9.99±1.53)％、(5.80±1.55)％、(3.58±0.73)％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 一定浓度的Fis在一定时段对生理状态下的HLEC增殖无明显影响.在氧化应激状态下,Fis呈时间和浓度依赖性地改善HLEC增殖能力,呈浓度依赖性地降低HLEC凋亡率.
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bFGF与ERK1/2阻断剂对人晶状体上皮细胞α平滑肌肌动蛋白mRNA表达的影响
目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellularsignal regulated kinase 1/2,ERK1/2)阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)mRNA表达的影响.方法 体外传代及培养HLEC,加入10 μg·L-1 bFGF及PD98059作用一定时间并根据作用时间进行分组.MTT法检测HLEC数量及存活率;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定HLEC中α-SMAmRNA的表达.结果 HLEC的存活率在bFGF作用组中随时间增长而增强,作用6h时达126.34％,作用1h组与作用6h组比较差异有统计学意义(P＜0.05);只加PD98059组细胞存活率仅30.03％,与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).bFGF作用剂量不变的情况下,随着作用时间延长,α-SMA mRNA表达明显增加,作用1h组与作用6h组差异有统计学意义(P ＜0.05);bFGF作用6h后,α-SMA mRNA值达高;加阻断剂PD98059作用后,α-SMA mRNA表达减少且随阻断剂作用时间延长表达进一步减少,作用lh组与作用6h组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 bFGF对HLEC具有促增殖作用,在低浓度剂量不变的前提下,呈现时间相关性.bFGF可促进HLEC分泌α-SMA,促进HLEC分化,并呈现时间及剂量相关性.
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白藜芦醇对过氧化氢诱导人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用
目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对过氧化氢(H2O2)诱导人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)氧化损伤的保护作用.方法 HLEC传代培养24h后,分别加入不同浓度(5μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1) RES预处理12 h后,加入100 μmol·L-1 H2O2继续孵育24 h,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,MTT比色法检测RES对H2O2诱导的HLEC活力的影响,流式细胞仪检测HLEC细胞凋亡率,比色法检测凋亡相关因子caspses-3及caspase-9的表达.结果 氧化损伤可以诱导HLEC形态改变,RES处理后,细胞形态逐渐得到改善.MTT结果显示RES对HLEC活性无抑制作用,RES(5μmol·L-1、10 μmol· L-1、20 μmol· L-1、40 μmol·L-1)孵育24 h后细胞存活率分别为(101.30±4.49)％、(100.31±3.53)％、(101.71±3.33)％、(99.30±3.00)％,与对照组(99.67±2.67)％比较,差异均无统计学意义(均为P＞0.05)；模型组HLEC经氧化损伤处理后,细胞存活率(34.33±3.71)％明显下降,用20 μmol·L-1及40 μmol·L-1 RES处理后,HLEC存活率分别提高到(57.33±5.61)％和(72.67±6.98)％,与模型组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).流式细胞计数结果显示:对照组HLEC凋亡率为(1.99±0.17)％,经H2O2处理后,模型组HLEC凋亡率为(51.73±4.97)％,20μmol·L-1、40 μmol·L-1 RES处理后,HLEC凋亡率分别为(34.43±3.67)％、(26.55±2.07)％,与模型组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).此外,RES还可以减少H2O2所致HLEC内caspses-3及caspase-9的表达.结论 RES可以明显抑制HLEC凋亡,其抑制凋亡的作用可能是其防止和延缓白内障发生发展的细胞学基础,从而为寻求有效的防治白内障药物提供可靠的实验依据.
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PUMA介导氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡
目的 探讨PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC)凋亡中的作用.方法 体外培养的HLEC-B3,用50 μmol·L-1H2O2刺激不同的时间后,Hoeehst 33258染色,凋亡细胞呈核固缩、碎裂形态,计数细胞凋亡率;采用Western blot方法检测PUMA及Capase-3蛋白的表达水平.采用RT-PCR方法检测PUMAmRNA表达水平;设计合成针对人PUMA基因的小干扰片段(siPUMA1、siPUMA2)和一条用性对照,用lipofectamine 2000转染细胞后,验证干扰有效性,观察其对氧化应激诱导的HLEC凋亡的影响.结果 H2O1刺激HLEC4 h、8h、12 h后,细胞凋亡率分别为3.30％±0.25％、27.16％±0.31％、48.14％±0.57％,凋亡相关蛋白Caspase-3发生时间依赖的表达上调.H2O2可诱导PUMA mRNA及蛋白质表达上调.干扰PUMA的表达能减少H2O2诱导的细胞凋亡,H2O2处理HLEC-B3 12 h后细胞凋亡率为48.24％± 0.84％,而敲除PUMA的表达后细胞凋亡率显著降低为13.72％±1.06％( siPUMA1)和17.56％±0.51％(siPUMA2).结论 PUMA介导了H2O2诱导的HLEC凋亡,可能在白内障的发生发展中发挥重要作用.
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高糖对人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响
目的 通过检测高糖对人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响,从基因角度探讨糖尿病患者白内障高发的机制.方法 体外培养人晶状体上皮细胞系,用不同浓度的葡萄糖孵育后,用四甲基偶氮唑盐比色法检测人晶状体上皮细胞活性,用荧光定量PCR方法检测多种凋亡相关基因的表达变化.结果 在以含不同浓度葡萄糖培养基培养细胞24 h后,发现晶状体上皮细胞活性在不同浓度的葡萄糖条件下产生明显变化,在葡萄糖浓度小于25.5 mmol·L-1时,晶状体上皮细胞增殖活力有少许提高,而当培养基中葡萄糖浓度大于35.5 mmol·L-1时,细胞增殖活力明显下降且呈刺量依赖性.同时该浓度下葡萄糖能够诱导多个凋亡相关基因高表达,其中凋亡基因p53和c-myc表达变化趋势与葡萄糖呈剂量依赖性,结果具有统计学意义(P＜0.05).结论 葡萄糖对人晶状体上皮细胞活性影响随浓度的改变而变化.高浓度下葡萄糖可通过诱导凋亡基因p53和C-myc高表达从而导致细胞凋亡.
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丙戊酸钠对体外培养的人晶状体上皮细胞增生的抑制作用
目的 探讨丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)对体外培养的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)增生和细胞周期的影响.方法 采用不同浓度的VPA(0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L～、4 mmol·L-1)作用于HLECs,四甲基偶氮唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测在不同时间点(24 h、48 h、72 h)VPA对细胞增生的抑制作用;流式细胞仪测定VPA(1 mmol·L-1、2 mmol·L-1)作用于HLECs 48 h后细胞周期分布情况;Western blot测定在VPA(1 mmol·L-1、2mmol·L-1)作用于HLECs 48 h后,细胞周期依赖性激酶抑制因子(p21)在蛋白质水平表达量的改变.结果 MTT检测显示VPA浓度≥0.5 mmol·L-1对体外HLECs增生的抑制作用呈时间和剂量依赖性.VPA作用48 h后,各药物浓度组(0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)细胞生长抑制率分别为11.05%、21.58%、26.67%和38.25%,流式细胞仪检测显示VPA可阻滞HLECs由G0/G1期向s期转换,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.经2 mmol·L-1VPA作用48 h,G0/G1期及S期细胞比例分别为(85.40±3.90)%和(7.35±1.47)%,与阴性对照组[(53.14±1.71)%和(35.31±1.14)%]比较差异具有统计学意义(P<0.05).Western blot检测发现VPA可促进p21蛋白质水平的表达.VPA处理48 h后,各组平均灰度比值分别为0.582±0.082(1 mmol·L-1)和0.914±0.113(2 mmol·L-1),与阴性对照组(0.303±0.029)比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 VPA可以通过促进p21表达,使HLEcs阻滞于G0/G1期,终抑制HLECs增生.
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骨连蛋白对人晶状体上皮细胞在人工晶状体上黏附的影响
目的 通过观察骨连蛋白的微量加入对晶状体上皮细胞黏附于人工晶状体表面的数目及形态特征的影响,探讨骨连蛋白有效抑制晶状体上皮细胞黏附的可行性.方法 传代培养永生化的人晶状体上皮细胞系SRA01/04,分别制备含0 mg·L-1、0.2 mg·L-1、1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1的骨连蛋白完全培养液,然后滴加到嵌入琼脂板的人工晶状体上,在CO2培养箱中连续培养.分别于培养1 d、3 d、7 d后,在倒置显微镜下观察细胞变化,并用血小板计数法计数人工晶状体表面黏附的细胞数,进行比较.结果 浓度为0.2 mg·L-1时骨连蛋白[作用1 d、3 d、7 d后黏附的细胞数分别为(266.25±4.97)mm-2、(270.82±7.47)mm-2、(241.44±17.14)mm-2]有抑制黏附的趋势,但与0 mg·L-1浓度组[作用1 d、3 d、7 d后黏附的细胞数分别为(274.63±6.67)mm-2、(277.78±7.37)mm-2、(261.71±13.23)mm-2]相比差异无统计学意义(P＞0.05);1.0 mg·L-1骨连蛋白[作用1 d、3 d、7 d后黏附的细胞数分别为(199.86±5.91)mm-2,(162.12±6.11)mm-2、(156.94±4.90)mm-2]即可见明确的抑制作用(P＜0.01);5.0 mg·L-1骨连蛋白[作用1 d、3 d、7 d后黏附的细胞数分别为(180.30±7.37)mm-2,(141.16±10.83)mm-2,(130.41±13.50)mm-2]作用更加明显(P=0.00).作用1 d时各浓度组未见明确改变(P＞0.05),3 d、7 d时可见明确的抑制作用(P＜0.01).结论 骨连蛋白可以抑制晶状体上皮细胞在人工晶状体表面黏附,其作用浓度及作用时间呈现正相关性.
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姜黄素对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用
目的 探讨姜黄素(curcumin,CUR)对人晶状体上皮细胞株 SRAO1/04(human lens epithelial cell line SRAO1/04,HLEC SRAO1/04)增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系.方法 MTT 比色法分别测定不同浓度的 CUR 作用于 HLEC 不同时间后的细胞生长抑制率;不同浓度的 CUR 作用于 HLEC 24 h 后,流式细胞术检测 HLEC 的细胞凋亡率;DAPI 免疫荧光染色观察 HLEC 的形态学改变;免疫组织化学检测 HLEC 的caspase-3 蛋白表达情况.结果 MTT 比色法实验结果显示,随药物浓度增加和作用时间延长,HLEC 生长抑制率增加(P＜0.05).CUR 作用于 HLEC 24 h 后,流式细胞术检测表明,细胞凋亡率随药物浓度增加而明显增加(P＜0.05);DAPI 免疫荧光染色可见细胞核固缩、溶解碎裂、产生凋亡小体,而对照组细胞形态规则,细胞核呈现均匀的荧光染色;免疫组织化学可见,用药组 caspase-3 蛋白的表达随 CUR 浓度增加而增强(P＜0.05).结论 CUR 对 HLEC 有抑制增生和诱导凋亡作用,且呈明显的剂量-效应与时间-效应关系,可望成为后发性白内障的防治药物.
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紫外线B照射对人晶状体上皮细胞质膜钙ATP酶3表达的影响
背景 细胞质膜钙ATP酶3(PMCA3)参与维持晶状体上皮细胞(LECs) Ca2+的平衡,可能与白内障的病理过程有关,紫外线B(UVB)是引起白内障的重要因素之一,但UVB对LECs中PMCA3表达的影响少有报道. 目的 研究UVB对人LECs系B-3(HLE B-3) PMCA3表达的影响. 方法 对HLE B-3细胞进行培养和传代,当细胞达80％以上融合时分别暴露于用不同剂量(0、5、10、20 mJ·s/cm2)的UVB分别照射0、20、40和80 s,然后继续培养24、48和72 h,用MTT法检测不同剂量UVB照射后细胞的生存率;用JC-1染色法检测UVB照射后细胞线粒体膜电位(△ψm)的变化;以DCFH-DA染色法检测UVB照射后细胞内活性氧簇(ROS)的变化;采用annexin V-FITC/PI染色法检测UVB照射后细胞的凋亡情况;用Fluo-3/AM染色法检测细胞内Ca2+浓度的变化;分别采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)法和Western blot法检测UVB照射后细胞中PMCA3 mRNA及PMCA蛋白的表达变化. 结果 随着UVB照射剂量的增加和照射时间的延长,细胞生存率均明显下降,差异均有统计学意义(F分组=72.411,P=0.000; F时间=36.588,P=0.000),其中10 mJ·s/cm2、20 mJ·s/cm2 UVB照射后24 h HLE B-3细胞的生存率分别为(75.3±2.2)％和(48.7±4.5)％,明显低于对照组的(100.0±0.0)％,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000);5、10、20 mJ·s/cm2 UVB照射后48 h细胞的生存率分别为(84.9±1.2)％、(69.3±17.4)％和(32.8±4.5)％,均明显低于对照组的(100.0±0.0)％,差异均有统计学意义(P=0.047、0.000、0.000);5、10、20 mJ·s/cm2 UVB照射后72 h细胞的生存率分别为(55.1±3.0)％、(42.1±1.9)％和(26.1±4.7)％,与对照组的(100.0±0.0)％相比生存率明显降低,差异均有统计学意义(均P=0.000).JC-1染色法检测表明,对照组细胞内可见红色荧光,5mJ·s/cm2 UVB照射后细胞内出现绿色荧光,10 mJ·s/cm2及20 mJ·s/cm2 UVB照射组出现绿色荧光增强,红色荧光减弱.5、10、20 mJ· s/cm2 UVB照射后细胞内的ROS由0.4％分别增加至35.8％、51.9％和76.7％.0 mJ·s/cm2 UVB照射组凋亡和坏死细胞比例为2.0％,5、10、20 mJ·s/cm2 UVB照射组凋亡和坏死细胞率分别为4.2％、7.6％和15.1％.10 mJ·s/cm2和20 mJ·s/cm2 UVB照射组细胞内Ca2+水平分别为0 mJ·s/cm2照射组的(1.2±0.1)倍和(1.3±0.1)倍,差异均有统计学意义(P=0.039、0.004).5、10和20 mJ·s/cm2 UVB照射组HLE B-3细胞PMCA3 mRNA表达量均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P=0.001、0.004、0.000),各组细胞中的PMCA蛋白相对表达量也均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.001). 结论 UVB照射可导致白内障发生的机制可能与人LECs中PMCA3表达量下降和诱导LECs凋亡有关,UVB的作用呈剂量和时间依赖性.
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雷帕霉素对转化生长因子-β2诱导的人晶状体上皮细胞上皮-间叶样转化的抑制作用及其机制
背景 转化生长因子-β2(TGF-β2)诱导的人晶状体上皮细胞(LECs)上皮细胞-肌成纤维细胞转化(EMT)过程是后发性白内障(PCO)的主要发病机制,因此寻求有效抑制这一作用的药物对于防治PCO有重要意义. 目的 观察雷帕霉素(RAPA)对人LECs增生和TGF-β2诱导的EMT的抑制作用. 方法 采用含质量分数10％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养液对人LECs系SRA01/04进行体外培养,换以无血清培养液培养后分别用TGF-β2(5 mg/L)、TGF-β2+ 10 mg/L RAPA、TGF-β2+ 100 mg/L RAPA、TGF-β2+ 1000 mg/LRAPA、TGF-β2+10 000 mg/L RAPA共培养SRA01/04 72 h,仅用无血清培养液培养的SRA01/04作为对照组.采用MTT法检测各组SRA01/04的吸光度(A490)值以评估SRA01/04的增生情况,并计算RAPA对细胞生长的抑制率.各组细胞作用48 h后,采用逆转录PCR(RT-PCR)法和Western blot法分别检测LECs ETM的标志物-α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮性钙黏附蛋白(E-cad)的表达.选取TGF-β2 +400 mg/L RAPA分别作用于培养的SRA01/04 24、48、72 h,采用Western blot法检测SRA01/04中α-SMA、E-cad的表达水平. 结果 MTT法检测结果显示,对照组、TGF-β2组、TGF-β2+10 mg/L RAPA组、TGF-β2+ 100 mg/L RAPA组、TGF-β2+1000 mg/L RAPA组和TGF-β2+10 000 mg/L RAPA组SRA01/04的A490值分别为0.680±0.020、0.550±0.013、0.480±0.014、0.400±0.011和0.200±0.019,表明随着RAPA质量浓度的增加,SRA01/04增生值降低,差异有统计学意义(F=101.920,P=0.000),且RAPA的抑制率逐渐增加.RT-PCR和Western blot检测结果表明,阴性对照组SRA01/04中α-SMA mRNA(α-SMA mRNA/β-actin mRNA)及其蛋白(α-SMA /β-actin)仅有少量表达,TGF-β2组可见SRA01/04中α-SMA mRNA及其蛋白表达量明显增加,但不同质量浓度的RAPA作用于SR A01/04后,随着RAPA质量浓度的增加,SRA01/04中α-SMA mRNA及蛋白的表达量均逐渐减少,但E-cadmRNA及其蛋白表达逐渐增多,各组间的总体差异均有统计学意义(α-SMA mRNA:F=294.660,P=0.000;α-SMA蛋白:F=346.950,P=0.000;E-cad mRNA:F=264.250,P=0.000;E-cad蛋白:F=317.327,P=0.000).400 mg/L RAPA作用于SRA01/04后,随着作用时间的延长,α-SMA蛋白的表达量逐渐下降,而E-cad蛋白的表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(α-SMA:F=693.864,P=0.000;E-cad:F=369.286,P=0.000). 结论 RAPA可抑制体外培养的SRA01/04增生,其作用呈剂量依赖性,此外RAPA具有抑制TGF-β2诱导的LECs ETM作用,其作用呈剂量和时间依赖性.
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干扰素/维甲酸诱导细胞凋亡相关基因19表达与紫外线诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的关系
背景 长期暴露于紫外线照射的环境中可通过破坏细胞线粒体的跨膜电位等机制促进相应组织中的细胞凋亡,包括人晶状体上皮细胞(LECs).干扰素/维甲酸诱导细胞凋亡相关基因-19(GRIM-19)位于线粒体呼吸链Ⅰ上,与紫外线照射诱导的LECs凋亡过程是否有关尚不明确. 目的 探讨GRIM-19与长波紫外线照射诱导的人LECs损伤的关系.方法 将人LECs系SRA01/04用常规培养方法在含质量分数10％胎牛血清的α-MEM培养液中进行培养,当细胞生长至对数生长期并达到80％融合时用长波紫外线照射,时间分别为5、10、15、20、25 min,长波紫外线剂量分别为30、60、90、120、150 mJ/cm2,照射后继续培养1h,对照组细胞与实验组培养方法相同,但不用长波紫外线照射.采用流式细胞技术测定各组培养的凋亡率,应用Western blot法检测各组培养上清液中GRIM-19蛋白的表达强度和相对表达量,采用单因素方差分析法对不同组间LECs凋亡率和GRIM-19蛋白相对表达量的差异进行比较,用Pearson积矩线性相关分析法评估LECs凋亡率与GRIM-19蛋白相对表达量的关系. 结果 不同剂量的紫外线照射培养的LECs后各组细胞凋亡率的总体比较差异有统计学意义(F=149.32,P＜0.01),其中60、90、120及150 mJ/cm2紫外线照射组与对照组比较,细胞凋亡率均明显增加,差异均有统计学意义(q=-17.02、-25.20、-29.41、-8.61,P＜0.01).不同剂量的紫外线照射培养的LECs后细胞上清液中GRIM-19的表达明显增强,各组LECs上清液中GRIM-19的相对表达量(GRIM-19/β-actin)的总体差异有统计学意义(F=6.87,P＜0.05),其中60、90、120、150 mJ/cm2紫外线照射组细胞上清液中GRIM-19的相对表达量分别为2.01±0.76、2.98±1.80、3.97±1.61和2.42±1.28,均明显高于对照组的0.56±0.23,差异均有统计学意义(q=-4.12、-5.04、-7.09、-3.85,P＜0.01).Pearson积矩线性相关分析结果表明,LECs上清液中GRIM-19蛋白的相对表达量与LECs凋亡率呈正相关(r=0.71,P＜0.01).结论 正常人LECs中可见GRIM-19的表达,但紫外线引起的人LECs凋亡过程与细胞中GRIM-19的表达上调一致;GRIM-19蛋白相对表达量与长波紫外线照射呈剂量依赖性.
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应激活化蛋白激酶信号通路及其靶基因对氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响
背景 白内障的发生与氧化应激诱导的晶状体上皮细胞(LECs)凋亡有关,而BH3-only蛋白是凋亡机制启动的关键因素,其过程可能与c-Jun N末段激酶(JNK)通路激活有关,但氧化应激诱导的LECs凋亡与JNK通路的关系尚未完全阐明.目的 探讨JNK/c-Jun通路及其靶基因Bim与PUMA在氧化应激诱导的LECs凋亡中的作用.方法 将人LECs系HLEC-B3在含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基中培养和传代.将80％融合的细胞接种在24孔板并随机分为无H2O2或H2O2(50 μmol/L)处理4、8、12h组,Hoechst 33258染色观察细胞形态并计数细胞凋亡率,采用Western blot法检测各组HLEC-B3细胞中JNK/c-Jun通路的激活情况和Bim、PUMA蛋白的表达水平,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测c-Jun、Bim、PUMA mRNA在HLEC-B3细胞中的表达.在H2O2处理的细胞培养基中加入JNK/c-Jun通路抑制剂CEP11004或SP600125处理4h,以无H2O2或H2O2+DMSO处理的细胞分别作为阴性和阳性对照组,Hoechst 33258染色观察各组LECs的凋亡情况并检测JNK/c-Jun通路的激活情况和Bim、PUMA蛋白的表达.当培养细胞达60％融合时,将200 pmol/L的Bim或PUMA小分子干扰片段转染细胞24 h,然后用H2O2处理细胞采用Western blot法和RT-PCR法检测Bim、PUMA蛋白及其mRNA在HLEC-B3细胞中的表达.结果 H2O2处理HLEC-B3 4、8、12h后,其细胞凋亡率的总体比较差异有统计学意义(F=1909.433,P=0.000),H2O2处理HLEC-B3 4、8、12h细胞凋亡率分别为(4.30±1.15)％、(27.08±0.74)％和(46.59±0.91)％,与无H2O2处理组(2.74±0.21)％比较差异均有统计学意义(P=0.049、0.000、0.000).与无H2O2处理组比较,不同时间H2O2处理组JNK/c-Jun通路的激活和Bim、PUMA蛋白及其mRNA在HLEC-B3细胞中的表达强度均明显增加；加入CEP11004或SP600125后,上述因子表达下调,与DMSO培养组比较凋亡率显著下降,差异均有统计学意义(均P=O.000).转染Bim或PUMA小分子干扰片段后,H2O2处理HLEC-B3 12 h组的细胞凋亡率明显高于Bim基因敲除组和PUMA基因敲除组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 H2O2诱导JNK激活并引起Bim、PUMA和c-Jun蛋白及其mRNA表达上调,其作用呈时间依赖性；抑制JNK/c-Jun通路及干扰Bim或PUMA的表达能对H2O2诱导的人LECs的凋亡起保护作用.
关键词： 人晶状体上皮细胞 氧化应激 凋亡 JNK/c-Jun通路 -
高糖刺激对人晶状体上皮细胞中KLF6基因表达的影响
背景 上皮-间充质转化(EMT)是后发性白内障的主要病理机制.锌指蛋白Kruppel样因子6( KLF6)在糖尿病肾病近曲小管中的表达增加,参与并促进转化生长因子-β(TGF-β)诱导的EMT.目的 观察高浓度葡萄糖刺激对人晶状体上皮细胞(LECs)中KLF6及其调控的靶基因转化生长因子β1(TGFB1)、转化生长因子βⅠ型受体(TGFBR1)、Ⅰ型胶原α1链(COLIAl)、热休克蛋白47(HSP47)等表达的影响.方法 用高浓度D-葡萄糖刺激人LECs系SRA01/04,运用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot法检测KLF6mRNA及蛋白水平,同时运用荧光定量PCR检测KLF6下游靶基因TGFBI、TGFBR1、COLlA1、HSP47的mRNA 表达水平.结果 与对照组(5.5 mmol/L)比较,高浓度葡萄糖(22.2、44.4、66.6 mmol/L)刺激后的t-KLF6和wt-KLF6 mRNA水平明显上升,差异均有统计学意义(F=72.53、42.02,P＜0.01)；结合人体血糖范围,在进一步实验中选择22.2 mmol/L作为葡萄糖刺激浓度.各时间点t-KLF6和wt-KLF6 mRNA水平之间的差异有统计学意义(F=100.12、125.52,P＜0.01),两者mRNA水平均于处理后12h达到高峰,24 h则开始出现下降,48 h下降更为明显.Western blot结果显示,对照组(0 h)KLF6蛋白表达很弱,高糖处理24 h后的细胞表达KLF6蛋白增加,而处理48 h后的表达量进一步增加.随着KLF6表达的增加,TGFB1、TGFBR1、COLlA1、HSP47的mRNA水平在高糖刺激12h时明显上升,但24 h后开始下降,48 h时进一步下降至接近对照组水平(F=6.73、162.35、64.39、12.05,P＜0.05). 结论 高浓度葡萄糖可诱导人LECs上调KLF6基因的表达,并短暂促进了其下游与EMT密切相关的靶基因TGFB1、TGFBR1、COLlA1、HSP47等的转录表达.
关键词： 人晶状体上皮细胞 高糖 Kruppel样因子6 上皮-间充质转化 -
重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响
背景 重组水蛭素Ⅲ(rHV3)对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞 (LECs)有较好的保护作用,但其分子机制尚不清楚.目的 探讨rHV3对半乳糖损伤的人LECs凋亡相关基因表达的影响.方法 用本课题组构建的表达重组水蛭素工程菌,参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行水蛭素生物学活性的测定.将培养的人LECs分为3组,培养于含质量分数10%胎牛血清(FBS)的D/F12培养液作为正常组、用含125×10-3mol/L D-半乳糖的D/F12培养液建立人LECs株SRA01/04损伤模型为模型组,用2000U/ml(商品单位)rHV3加入部分损伤模型培养液中进行干预作为rHV3组.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组人LECs内凋亡相关基因的表达,包括醛糖还原酶(AR)、bcl2、bax、p53基因mRNA的表达水平,各目的基因表达丰度用目的基因的吸光度(A)值与3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)A值的比值表达.结果 与正常组比较,模型组人LECs中AR mRNA/GAPDH mRNA、bax mRNA/GAPDH mRNA和p53 mRNA/GAPDH mRNA值明显高于对照组,差异均有统计学意义(t=3.90E-06、t=8.44E-04、t=5.15E-08,P＜0.01),而水蛭素干预组人LECs中AR mRNA/GAPDH mRNA、bax mRNA/GAPDH mRNA和p53 mRNA/GAPDH mRNA值明显低于模型组,差异均有统计学意义(t=5.90E-06、t=1.51E-04、t=3.42E-06,P＜0.01).与正常组比较,模型组人LECs中的bcl2 mRNA/GAPDH mRNA值明显降低,差异有统计学意义(t=1.86E-05,P＜0.01),与模型组相比,水蛭素干预后人LECs中的bcl2 mRNA/GAPDH mRNA值显著提高,差异有统计学意义(t=8.56E-05,P＜0.01).结论 D-半乳糖导致人LECs损伤,rHV3可能通过抑制多元醇途径和线粒体介导的凋亡途径对人LECs起保护作用.
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丝裂素蛋白激活激酶信号途径介导水杨酸钠诱导的人晶状体上皮细胞中HSP27表达
背景 热休克蛋白(HSPs)是生物体在各种应激情况下产生的高度保守蛋白,HSP27与人晶状体中α-晶状体蛋白在氨基酸和基因水平上高度同源,其结构和表达的异常与白内障的形成密切相关.此研究先前的研究证实水杨酸钠对H2O2造成的人晶状体上皮细胞(LECs)损伤具有保护作用.目的 探讨水杨酸钠诱导的人LECs中HSP27的表达及与丝裂素蛋白激活激酶(MAPK)信号途径的关系.方法 人LECs.B3 系在含质量分数15%胎牛血清的DMEM中进行培养,将不同浓度的水杨酸钠(0～55 mmoL/L)加入培养基中刺激人LECs不同时间,然后去除刺激再分别培养.在阻断实验中,分别给予P38 MAPK、ERK1/2及JNK/SAPK信号通路特异性阻断剂SB20350(10 μmol/L)、PD98059(20 μmol/L)及SP600125(10 μmol/L)预孵育细胞1 h,在给予水杨酸钠刺激后检测相关指标,采用Western blot法检测各种处理情况下人LECs中HSP27的表达,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HSP27 mRNA的表达;免疫组织化学法检测HSP27蛋白在人LECs中的表达.结果正常人LECs仅有微弱的HSP27表达,35～55 mmoL/L水杨酸钠刺激人LECs 1 h去除刺激再培养6 h后可使HSP27表达显著增加,与正常对照组比较差异有统计学意义(F=509.953,P<0.01);55 mmol/L水杨酸钠刺激人LECs 1～5 h不能诱导HSP27的表达(F=2.119,P>0.05),而去除刺激再分别培养6 h后可诱导HSP27表达,差异有统计学意义(F=452.534,P<0.01);55 mmol/L水杨酸钠刺激人LECs 1 h后去除刺激再培养3 h后HSP27表达明显增加,6 h达到高峰,直至24 h恢复到基础水平,差异有统计学意义(F=419.234,P<0.01).水杨酸钠刺激30 min时磷酸化p38MAPK表达增加,1 h表达显著,各组总体差异有统计学意义(F=865.680,P<0.01);磷酸化ERK 1/2在水杨酸钠刺激时间内未见升高;去除水杨酸钠刺激再培养1 h后开始增加,6 h达到高峰,各时间点总体差异有统计学意义(F=388.840,P<0.01);水杨酸钠刺激1 h及去除刺激再培养过程中未见到磷酸化JNK的表达;加入P38MAPK、ERK1/2特异性阻断剂预处理人LECs 1 h后可使水杨酸钠诱导的HSP27表达受到显著抑制,加入JNK特异性阻断剂未见对水杨酸钠诱导的HSP27表达产生影响.结论水杨酸钠可诱导人LECs中HSP27的表达,P38MAPK和ERK1/2信号途径促进水杨酸钠诱导的HSP27在人LECs中的表达.
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NO-Fluvastain对体外培养的人LECs增生作用的实验研究
目的 研究NO-Fluvastain对体外培养的人晶状体上皮细胞(LECs)增生的影响及其作用机制.方法 用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞增生;流式细胞仪测定细胞周期;RT-PCR测定细胞周期调控蛋白CyclinE mRNA和P21waf1 mRNA表达.结果MTI 检测显示NO-Fluvastain对体外人LECs的增生具有显著抑制作用,并且表现出时间和剂量依赖关系.流式细胞仪检测发现:NO-Fluvastain可阻滞人LECs由G0/G1期向S期转换,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.RT-PCR检测发现:NO-Fluvastain可抑制CyclinE mRNA表达,促进P21waft.mRNA表达.与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 NO-Fluvastain通过抑制CyclinE mRNA表达,促进P21waf1 mRNA表达,使人LECs阻滞于G0/G1期,从而抑制人LECs增生.
关键词： 后发性白内障 NO-Fluvastain 人晶状体上皮细胞 细胞周期 调控蛋白 -
中波紫外线和氧化应激诱导LECs中Ⅰ型胶原降解的分子机制研究
目的 探讨中波紫外线(UVB)和氧化应激诱导人晶状体上皮细胞(LECs)中Ⅰ型胶原降解的时间和剂量依赖方式及其作用信号通路.方法 培养人LECs,用UVB(15 mJ/cm2)或H2O2(100 μmol/L)分别处理细胞,Western blot法检测不同时间段的Ⅰ型胶原表达和JNK、c-Jun的磷酸化,Glatin酶谱法分析不同时间段的间质胶原酶(MMP-1)表达,且用不同剂量的UVB辐射或不同浓度H2O2作用后检测上述指标.结果 在用UVB和H2O2处理后,Ⅰ型胶原的表达明显下降,8 h后为0.890,24 h后为0.779.UVB和H2O2以时间和剂量依赖的方式诱导JNK-1和c-Jun的磷酸化,MMP-1的表达也以时间依赖的方式增加.结论 在人工培养的人LECs中,UVB、H2O2通过时间和剂量的方式诱导JNK和c-Jun的磷酸化,导致MMP-1和Ⅰ型胶原表达,这一作用通路可能形成潜在的治疗后发性白内障的靶点.
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EGF-R酪氨酸蛋白激酶在紫外线及EGF诱导的人LECs前列腺素E2合成中的作用
目的 探讨表皮生长因子受体(EGF-R)酪氨酸蛋白激酶途径在紫外线引起的人晶状体上皮细胞(LECs)前列腺素E2(PGE2)合成增加过程中的作用.方法 体外培养人LECs,分别用紫外线照射,表皮生长因子(EGF)、酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein处理,用酶联免疫法检测培养液中PGE2质量分数的变化,用Western blot和免疫组织化学染色法检测LECs中EGF-R酪氨酸蛋白激酶磷酸化水平的变化.结果 EGF与单纯紫外线照射均可引起培养的人LECs中PGE2的合成明显增加(P＜0.05);先给予紫外线照射后再加入EGF未能使PGE2合成进一步增加(P＞0.05);事先给予Genistein处理可以明显抑制由紫外线或EGF引起的PGE2升高(P＜0.05).紫外线照射组、EGF处理组、紫外线及EGF联合处理组均可见到EGF-R的磷酸化增强,并可以被Genistein抑制.结论 紫外线和EGF引起的LECs中PGE2合成增加可能由EGF-R-酪氨酸蛋白激酶途径诱导.
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小白菊内酯对氧化应激诱导人晶状体上皮细胞凋亡的防护作用
目的 探讨植物成分小白菊内酯对过氧化氢(H2O2)诱导的人晶状体上皮细胞(LECs)凋亡的保护作用及其作用机制.方法 人LECs(SRA0l-04)用50μmol/L的H2O2诱导凋亡,同时加入不同浓度(0、10、20、50μmol/L)的小白菊内酯观察细胞形态变化;用流式细胞仪检测细胞凋亡,用实时定量反转录PCR以及Western blot检测caspase-3和caspase-9的表达.结果 H2O2能明显诱导人LECs凋亡,促进caspase-3和caspase-9在转录水平和蛋白水平的表达;小白菊内酯能明显抑制H2O2诱导的人LECs凋亡,抑制caspase-3和caspase-9的表达,而作用呈浓度依从性.结论 小白菊内酯对氧化应激诱导的人LECs凋亡具有保护作用,提示可能对白内障的发生具有潜在的防治作用.
