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GM-CSF通过JNK/c-Jun通路介导成纤维细胞MMP2/MMP9的表达
目的 探讨粒细胞单核巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对人皮肤成纤维细胞表达基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9(MMP2/MMP9)的影响及其相关机制.方法 ELISA法和明胶酶谱检测不同GM-CSF浓度(0、10、50、100和500 ng/mL)刺激下成纤维细胞上清液内MMP2/MMP9的浓度及活性;Western blotting和real-time PCR分别用于检测GM-CSF或SP600125+GM-CSF处理组成纤维细胞后MMP2/MMP9/JNK/p-JNK/c-Jun/p-c-Jun的蛋白水平以及MMP2/MMP9的mRNA水平;ELISA法检测GM-CSF或SP600125+GM-CSF处理成纤维细胞不同时间(6、12、24和48 h)后细胞上清内MMP2/MMP9的浓度.结果 GM-CSF可以显著诱导人皮肤成纤维细胞MMP2/MMP9的表达与分泌(P＜0.05),且分泌的MMP2/MMP9浓度及活性与GM-CSF浓度呈正相关;GM-CSF处理成纤维细胞后,JNK及c-Jun蛋白的磷酸化水平和MMP2/MMP9的mRNA水平均高于对照组(P＜0.05),若经SP600125预处理,GM-CSF诱导的c-Jun磷酸化水平则显著被抑制(P＜0.05),且MMP2/MMP9的mRNA水平也明显降低(P＜0.05);GM-CSF诱导成纤维细胞MMP2/MMP9的表达在24 h时达到高值,24 ～ 48 h逐渐降低(P＜0.05);若将SP600125与GM-CSF共处理成纤维细胞,MMP2的表达水平则显著低于对照组,MMP9的表达水平却略高于对照组.结论 GM-CSF能够通过活化JNK/c-Jun信号通路来诱导成纤维细胞MMP2/MMP9的表达和分泌.
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应激活化蛋白激酶信号通路及其靶基因对氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响
背景 白内障的发生与氧化应激诱导的晶状体上皮细胞(LECs)凋亡有关,而BH3-only蛋白是凋亡机制启动的关键因素,其过程可能与c-Jun N末段激酶(JNK)通路激活有关,但氧化应激诱导的LECs凋亡与JNK通路的关系尚未完全阐明.目的 探讨JNK/c-Jun通路及其靶基因Bim与PUMA在氧化应激诱导的LECs凋亡中的作用.方法 将人LECs系HLEC-B3在含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基中培养和传代.将80％融合的细胞接种在24孔板并随机分为无H2O2或H2O2(50 μmol/L)处理4、8、12h组,Hoechst 33258染色观察细胞形态并计数细胞凋亡率,采用Western blot法检测各组HLEC-B3细胞中JNK/c-Jun通路的激活情况和Bim、PUMA蛋白的表达水平,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测c-Jun、Bim、PUMA mRNA在HLEC-B3细胞中的表达.在H2O2处理的细胞培养基中加入JNK/c-Jun通路抑制剂CEP11004或SP600125处理4h,以无H2O2或H2O2+DMSO处理的细胞分别作为阴性和阳性对照组,Hoechst 33258染色观察各组LECs的凋亡情况并检测JNK/c-Jun通路的激活情况和Bim、PUMA蛋白的表达.当培养细胞达60％融合时,将200 pmol/L的Bim或PUMA小分子干扰片段转染细胞24 h,然后用H2O2处理细胞采用Western blot法和RT-PCR法检测Bim、PUMA蛋白及其mRNA在HLEC-B3细胞中的表达.结果 H2O2处理HLEC-B3 4、8、12h后,其细胞凋亡率的总体比较差异有统计学意义(F=1909.433,P=0.000),H2O2处理HLEC-B3 4、8、12h细胞凋亡率分别为(4.30±1.15)％、(27.08±0.74)％和(46.59±0.91)％,与无H2O2处理组(2.74±0.21)％比较差异均有统计学意义(P=0.049、0.000、0.000).与无H2O2处理组比较,不同时间H2O2处理组JNK/c-Jun通路的激活和Bim、PUMA蛋白及其mRNA在HLEC-B3细胞中的表达强度均明显增加；加入CEP11004或SP600125后,上述因子表达下调,与DMSO培养组比较凋亡率显著下降,差异均有统计学意义(均P=O.000).转染Bim或PUMA小分子干扰片段后,H2O2处理HLEC-B3 12 h组的细胞凋亡率明显高于Bim基因敲除组和PUMA基因敲除组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 H2O2诱导JNK激活并引起Bim、PUMA和c-Jun蛋白及其mRNA表达上调,其作用呈时间依赖性；抑制JNK/c-Jun通路及干扰Bim或PUMA的表达能对H2O2诱导的人LECs的凋亡起保护作用.
关键词： 人晶状体上皮细胞 氧化应激 凋亡 JNK/c-Jun通路
