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雷帕霉素对转化生长因子-β2诱导的人晶状体上皮细胞上皮-间叶样转化的抑制作用及其机制
背景 转化生长因子-β2(TGF-β2)诱导的人晶状体上皮细胞(LECs)上皮细胞-肌成纤维细胞转化(EMT)过程是后发性白内障(PCO)的主要发病机制,因此寻求有效抑制这一作用的药物对于防治PCO有重要意义. 目的 观察雷帕霉素(RAPA)对人LECs增生和TGF-β2诱导的EMT的抑制作用. 方法 采用含质量分数10％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养液对人LECs系SRA01/04进行体外培养,换以无血清培养液培养后分别用TGF-β2(5 mg/L)、TGF-β2+ 10 mg/L RAPA、TGF-β2+ 100 mg/L RAPA、TGF-β2+ 1000 mg/LRAPA、TGF-β2+10 000 mg/L RAPA共培养SRA01/04 72 h,仅用无血清培养液培养的SRA01/04作为对照组.采用MTT法检测各组SRA01/04的吸光度(A490)值以评估SRA01/04的增生情况,并计算RAPA对细胞生长的抑制率.各组细胞作用48 h后,采用逆转录PCR(RT-PCR)法和Western blot法分别检测LECs ETM的标志物-α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮性钙黏附蛋白(E-cad)的表达.选取TGF-β2 +400 mg/L RAPA分别作用于培养的SRA01/04 24、48、72 h,采用Western blot法检测SRA01/04中α-SMA、E-cad的表达水平. 结果 MTT法检测结果显示,对照组、TGF-β2组、TGF-β2+10 mg/L RAPA组、TGF-β2+ 100 mg/L RAPA组、TGF-β2+1000 mg/L RAPA组和TGF-β2+10 000 mg/L RAPA组SRA01/04的A490值分别为0.680±0.020、0.550±0.013、0.480±0.014、0.400±0.011和0.200±0.019,表明随着RAPA质量浓度的增加,SRA01/04增生值降低,差异有统计学意义(F=101.920,P=0.000),且RAPA的抑制率逐渐增加.RT-PCR和Western blot检测结果表明,阴性对照组SRA01/04中α-SMA mRNA(α-SMA mRNA/β-actin mRNA)及其蛋白(α-SMA /β-actin)仅有少量表达,TGF-β2组可见SRA01/04中α-SMA mRNA及其蛋白表达量明显增加,但不同质量浓度的RAPA作用于SR A01/04后,随着RAPA质量浓度的增加,SRA01/04中α-SMA mRNA及蛋白的表达量均逐渐减少,但E-cadmRNA及其蛋白表达逐渐增多,各组间的总体差异均有统计学意义(α-SMA mRNA:F=294.660,P=0.000;α-SMA蛋白:F=346.950,P=0.000;E-cad mRNA:F=264.250,P=0.000;E-cad蛋白:F=317.327,P=0.000).400 mg/L RAPA作用于SRA01/04后,随着作用时间的延长,α-SMA蛋白的表达量逐渐下降,而E-cad蛋白的表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(α-SMA:F=693.864,P=0.000;E-cad:F=369.286,P=0.000). 结论 RAPA可抑制体外培养的SRA01/04增生,其作用呈剂量依赖性,此外RAPA具有抑制TGF-β2诱导的LECs ETM作用,其作用呈剂量和时间依赖性.
