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商陆皂苷甲肠黏膜损伤与泻下作用及其机制研究
目的 研究商陆皂苷甲的肠黏膜损伤与泻下作用及其机制.方法 实验分为空白组、商陆生品组、商陆皂苷甲高剂量组和低剂量组.免疫组织化学和实时荧光定量PCR的方法检测各实验组大鼠结肠黏膜粘蛋白2(MUC2)和水通道蛋白9(AQP9)的表达.结果 PCR结果显示商陆生品组、商陆皂苷甲高剂量组和低剂量组MUC2表达较空白组降低(P<0.05).商陆生品组、商陆皂苷甲高剂量组和低剂量组AQP9的表达较空白组升高(P<0.05).免疫组化结果显示空白组MUC2阳性明显,着棕黄色.商陆皂苷甲低剂量组可见零星的棕黄色阳性着色,商陆生品组和商陆皂苷甲高剂量组未见棕黄色.空白组AQP9着色浅,商陆生品组、商陆皂苷甲高剂量组和低剂量组阳性着色加深.结论 商陆皂苷甲和商陆生品均可以降低大鼠结肠黏膜组织MUC2的表达损伤结肠黏膜.通过增加肠黏膜AQP9的表达发挥泻下作用.
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商陆皂苷甲致肾细胞毒性的研究
目的：考察商陆皂苷甲Esculentoside A（EsA）对人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）的毒性。方法：1）MTT法测细胞活力；2）检测细胞上清液LDH、细胞内SOD及MDA；3）采用倒置显微镜及电镜观察细胞形态学；4）采用Hoechst-PI染色及流式细胞仪观察细胞凋亡的情况。结果：1）EsA对肾细胞的活力有显著的抑制作用，其IC50为149.11μg· mL-1，且存在一定的时效和量效关系；2）EsA能升高肾细胞培养上清中的LDH，使肾细胞内SOD/MDA比值有所下降；3）EsA能使肾细胞及其超微结构发生变化，出现凋亡或坏死，有一定的量效关系。结论：大于100μg· mL-1浓度的商陆皂苷甲对HK-2细胞有一定的毒性，其毒性机制与细胞氧化应激、凋亡等相关。
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商陆醋炙前后化学成分和药效比较
目的:比较商陆醋炙前后化学成分和药效的变化情况.方法:按2010年版《中国药典》商陆项下醋炙法制备醋商陆.采用硫酸-香草醛比色法测定总皂苷含量;HPLC-ELSD测定商陆皂苷甲含量,色谱条件为Lichrospher-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相甲醇-0.4％乙酸(65∶ 35),流速1.0 mL·min-1,柱温40℃,进样量20 μL,ELSD条件为漂移管温度90℃,载气流速2.5L·min-.SD大鼠随机分成生理盐水组、阳性药组(氢氯噻嗪)、生商陆组和醋商陆组,以生理盐水形成盐水负荷模型,用大鼠代谢笼法观察大鼠0～5h尿量;ICR小鼠随机分成生理盐水组、阳性药组(芒硝)、生商陆组和醋商陆组,采用墨汁推进法比较生商陆和醋商陆对小鼠小肠推进率的影响.结果:商陆经醋炙后总皂苷质量分数由1.66％升至1.91％,商陆皂苷甲质量分数由0.64％增至0.82％,大鼠排尿量增多,小鼠小肠推动作用减弱.结论:商陆醋炙后总皂苷和商陆皂苷甲含量均升高,泻下作用缓和,长于利尿逐水.
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商陆不同炮制品对大鼠的利尿作用及其对睾丸、肾脏水通道蛋白的调节作用
目的:研究商陆生品及不同炮制品的利尿作用,初步探究其利尿作用机制.方法:采用水负荷大鼠模型,将80只SD大鼠随机分为空白组、模型组、商陆皂苷甲(EsA)组、生品组、不同炮制品(醋炙、醋煮、水煮、清蒸)组,每组10只.同时进行正常状态大鼠利尿实验,将70只SD大鼠随机分为空白组,EsA组,生品组及不同炮制品(醋炙、醋煮、水煮、清蒸)组,每组10只.各给药组的剂量分别为0.005,1.8,1.8,1.8,1.8,1.8 g·kg-1,通过给予水负荷模型大鼠及正常大鼠不同的药物,分别测定排尿量,并进行水负荷大鼠大鼠睾丸水通道蛋白9(AQP9)因子表达、肾组织AQP2和AQP4因子的表达试验及正常大鼠睾丸AQP9因子的表达试验.结果:综合6h总尿量,EsA,商陆生品及不同炮制品均对水负荷大鼠表现出利尿作用;对于正常大鼠仅醋煮品表现出利尿作用.聚合酶链式反应(PCR)技术中对于水负荷大鼠,AQP2 mRNA表达均显著降低,AQP4和AQP9 mRNA表达大部分无显著变化;对于正常大鼠,醋煮组AQP9 mRNA表达显著降低,其余各组无显著变化.结论:商陆对于水负荷大鼠表现出利尿作用,但对正常大鼠利尿作用不明显;商陆的利尿作用可能与AQP2和AQP9 mRNA表达下降有关.
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商陆水溶性浸出物、商陆皂苷甲含量变异规律与优良种源筛选
目的:为商陆种质资源利用与优良品种选育提供依据.方法:收集全国主分布区商陆野生种质资源23份,考察其经纬度、海拔、农艺性状,用热浸法测定块根水溶性浸出物含量,用HPLC-ELSD法测定块根商陆皂苷甲含量,用DPS 6.55,Excel 2003软件进行单因素方差分析、相关性分析、主成分分析与聚类分析.结果:商陆不同种源间农艺性状存在显著差异(P＜0.05),其中福建、广两种源生长势好,植株高大,茎粗,叶片大而多狭长,块根产量高;不同种源间水溶性浸出物、商陆皂苷甲含量也存在显著差异(P＜0.05),2个成分变异规律相似,与种源地、经纬度、海拔、农艺性状存在相关性,其中陕西、浙江种源含量较高;与株高、茎粗、叶片长、叶片宽、叶柄长、块根纵径、块根横径、块根产量呈负相关关系,与根形指数、纬度、海拔呈正相关关系,与叶形指数、经度相关性较低;12个生长与成分性状指标可简化为5个主成分,累计贡献率达93.611 9％;23个种源可划分为5类.结论:高纬度、高海拔种植商陆有利于块根中水溶性浸出物与商陆皂苷甲含量积累;共筛选出5个农艺性状优良种源与4个高成分含量优良种源,可作为高产、优质商陆品种选育备选种质.
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商陆皂苷甲对大鼠Heymann肾炎的治疗作用及对细胞因子的影响
目的: 商陆皂苷甲(EsA)对大鼠Heymann肾炎(passive Heymann nephritis,PHN)的治疗作用及机理.方法: 大鼠sc Fx1A抗原的抗体制成自身免疫性肾小球肾炎,EsA 5,10和20 mg·kg-1·d-1 ip,连续14 d.结果: EsA可以显著减少肾炎大鼠尿蛋白的产生,电镜和免疫荧光检查发现EsA治疗后肾炎大鼠病理情况明显好转.EsA治疗对血清中炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL-1)和白细胞介素6(IL-6)的产生具有显著的抑制作用.结论: EsA对大鼠Heymann肾炎具有显著治疗作用,抑制细胞因子产生可能参与EsA抗炎机制.
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商陆皂苷甲对细胞间粘附的影响
目的研究商陆皂苷甲(EsA)对细胞间粘附的影响，并观察粘附分子ICAM-1和CD18 mRNA的表达水平。方法用血细胞计数仪计数的方法考察在脂多糖（LPS）诱导下，EsA对中性粒细胞与内皮细胞间粘附的影响。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法测定内皮细胞ICAM-1 mRNA和中性粒细胞CD18 mRNA的表达水平。结果EsA在3～12×10－6μmol*L-1能降低LPS作用下中性粒细胞与内皮细胞间高水平的粘附率，且能降低LPS诱导下内皮细胞ICAM-1 mRNA和中性粒细胞CD18 mRNA的表达。结论EsA能抑制LPS作用下中性粒细胞与内皮细胞间的粘附可能是其抗炎机制之一，降低粘附分子的表达可能是其影响细胞间粘附的重要作用机制。
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基于转录组测序挖掘商陆皂苷甲生物合成相关基因
为研究商陆皂苷甲的生物合成途径,利用Illumina HiSeq 4000高通量测序技术对商陆幼苗进行转录组测序,得到9.60 Gb clean data,经Trinity软件组装后获得63 957条unigenes,平均长度988.82 bp,其中24 517条unigenes (38.33％)能被Nr、Swiss-Prot、COG、KOG、Pfam、GO、KEGG等公共数据库注释.对注释得到的unigenes进行KEGG代谢通路分析,发现商陆转录组中有53个unigenes参与萜类骨架合成通路,有8个unigenes参与三萜合成通路,还有417个unigenes参与商陆其他次生代谢途径.进一步分析参与商陆皂苷甲生物合成后修饰酶相关基因,发现有130个unigenes可能具有CYP450的功能,参与商陆次生代谢产物的氧化/羟基化修饰;有46个unigenes与糖基转移酶UGT相关.商陆转录组数据的获得为研究商陆皂苷甲和其他次生代谢产物的生物合成途径奠定了基础,也为商陆药材品质的形成提供理论依据.
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HPLC－UV法测定商陆中商陆皂苷甲的含量
目的：建立商陆中商陆皂苷甲的HPLC－UV测定方法。方法用Alltima C18色谱柱（4．6 mm ×250 mm，5μm），流动相：乙腈－0．1％磷酸水＝40∶60，流速：0．8 mL? min－1，检测波长：203 nm，考察该方法的专属性、标准曲线和定量下限、精密度与回收率、稳定性以及重现性。结果商陆皂苷甲在0．15～3．86μg内，线性关系良好，定量下限0．039μg，精密度良好（日内、日间 RSD 分别为1．12％和1．89％），平均回收率为98．61％。10个不同产地样品中商陆皂苷甲的含量为0．05％～0．42％。结论本方法简单，重复性好，适合用于商陆药材的质量控制。
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LC-IT-MS/MS法测定大鼠体内商陆皂苷甲浓度及其药动学研究
目的:建立测定SD大鼠体内商陆皂苷甲(EsA)血药浓度的高效液相-离子阱串联质谱方法；研究EsA在SD大鼠体内的药动学特征.方法:采用Diamonsil C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,3μm),流动相为甲醇-水(含0.1％冰醋酸)(70:30),流速为0.2 mL· min-1,采用ESI源,正离子检测模式,以人参皂苷Rg1为内标,血浆样品经正丁醇液液萃取后进样分析,测定大鼠血浆中EsA浓度,BAPP软件计算主要药动学参数.结果:在选定的色谱条件下,EsA和内标分离良好,没有内源性物质干扰.EsA在5～500 ng·mL-1范围内线性良好(r =0.998 3),低定量限为5 ng· mL-1,提取回收率大于70％,日内和日间精密度小于10％.SD大鼠灌胃给予EsA 15 mg· kg-1后,其主要药动学参数AUC0～24h为(1 013.85 ±82.73) ng·h·mL-1,AUC0-∞为(1 076.31 ±92.70) ng·h·mL-1,t1/2为(6.16±0.63)h,Cmax为(218.80 ±38.33) ng·mL-1,Tmax为(0.8±0.1)h.结论:本方法简便快捷、灵敏准确；本研究所获得的EsA在SD大鼠体内的药动学参数为EsA的临床应用提供了依据.
关键词： 高效液相-离子阱串联质谱法 商陆皂苷甲 SD大鼠 血药浓度 药动学 -
商陆皂苷甲对白细胞介素1β诱导的肾小球系膜细胞增殖及Caspase-3的影响
目的：观察商陆皂苷甲(EsA)对白细胞介素1β（IL-1β）诱导的大鼠肾小球系膜细胞(rGMC)增殖及Caspase-3表达的影响，探讨EsA治疗狼疮性肾炎等系膜细胞增殖性肾小球肾炎的可能机制。方法 MTT法检测不同浓度的EsA对rGMC增殖的影响；蛋白质印迹法检测Caspase-3的表达，并成像分析。结果观察剂量中EsA对rGMC没有明显的细胞毒作用，EsA作用rGMC 48 h后抑制细胞增殖的有效浓度为2.5～5.0 mg/L(P＜0.05或P＜0.01)；IL-1β促进了rGMC的Caspase-3的表达(P＜0.01)，与IL-1β组比较，EsA+IL-1β组对rGMC的Caspase-3的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论在体外EsA(2.5～5 mg/L)可显著抑制rGMC的增殖，GMC可能是EsA的作用靶细胞；但其促凋亡作用不明显。
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高效液相色谱法测定商陆植物中皂苷甲的含量
目的:建立高效液相色谱法测定商陆植物中皂苷甲的含量.方法:采用蒸发光散射检测器,高效液相色谱法测定含量,色谱柱为YWG-C18(4.6 mm×250 mm,5μg);流动相为水:甲醇(66:34);流速1.0 ml/min;检测波长207nm.结果:线性范围为1.04μg～9.36μg(r=0.9995,n=5),回收率为100.5%,RSD为1.1%.结论:该法可用于商陆植物中皂苷甲的含量测定.
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醋商陆饮片的炮制工艺研究
目的 确定醋商陆饮片的佳炮制工艺.方法 选择炒制温度、炒制时间和加醋量3个因素,采用L9(34)正交试验设计,以RP-HPLC法测定炮制品中活性成分商陆皂苷甲的量,以小鼠胃肠道试验评价刺激性毒性,通过多指标综合评分法优选醋商陆的炮制工艺.结果 优选出的醋商陆炮制工艺为:加入30%醋拌匀,闷润至醋被吸尽,于120℃炒制30 min.结论 优选出的醋商陆炮制工艺稳定可行,重现性好.
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商陆皂苷甲对 BXSB 小鼠狼疮肾炎凋亡的影响
目的：通过观察商陆皂苷甲（ EsA）对BXSB小鼠肾脏细胞凋亡的影响，探讨EsA对狼疮肾炎的作用机制。方法将24只18周龄雄性BXSB小鼠随机分为模型组、地塞米松组和EsA组，腹腔注射相应药物治疗4周后留取肾组织标本，采用原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡情况，免疫组化检测组织中Bax、Bcl－2、Fas、FasL表达情况。结果①3组间肾小球和肾小管细胞的凋亡指数差异有统计学意义（P＜0．05），EsA组凋亡指数高，其次为地塞米松组。②与模型组比较，两治疗组小鼠肾组织 Bcl －2光密度值显著下降（ P ＜0.05），EsA和地塞米松治疗组间无统计学差异（P＞0．05）；3组间Bax的表达比较差异无统计学意义（P＞0．05）；而3组间肾组织 Bcl －2／Bax 的比值比较差异有统计学意义（ P ＜0.05）。③与模型组比较，两治疗组BXSB小鼠的肾组织Fas、FasL 光密度值明显增加（P＜0．05），EsA和地塞米松治疗组间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 EsA具有诱导BXSB小鼠肾小球和肾小管细胞凋亡作用，其通过下调BXSB小鼠肾组织中Bcl－2表达及上调Fas、FsaL表达而促进细胞凋亡的发生。
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商陆皂苷甲对大鼠抗Thy1系膜增生性肾炎的治疗作用
目的:探讨商陆皂苷甲(EsA)对大鼠抗Thy1系膜增生性肾炎的治疗作用.方法:制备大鼠抗Thy1系膜增生性肾炎模型,随机分为EsA治疗组、地塞米松治疗组、未治疗组(模型组).另设正常对照组.隔日测定24 h尿蛋白定量.所有大鼠第8天处死,取肾脏组织,显微镜观察肾组织系膜增生程度,利用图像分析系统对系膜区占据肾小球面积进行分析.结果:EsA治疗组及地塞米松治疗组3、5、7天24 h尿蛋白与模型组相应时间点比较均明显下降(P＜0.01～0.001);EsA治疗组及地塞米松治疗组肾小球系膜细胞及基质增生程度较模型组明显减轻(P＜0.05).结论:EsA对大鼠抗Thy1系膜增生性肾炎具有降低尿蛋白、抑制肾小球系膜细胞及系膜基质的增生的作用.
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商陆皂苷甲对BXSB小鼠肾组织PCNA、 Caspase-3、 Fas和FasL表达影响
[目的]观察商陆皂苷甲(esculentosideA,EsA)对BXSB小鼠肾组织细胞增殖核抗原(PCNA)、半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)、凋亡诱导因子(Fas)和凋亡诱导因子配体(FasL)蛋白表达影响.[方法]将24只18周龄雄性BXSB小鼠随机分为模型组、地塞米松组和商陆皂苷甲(EsA)组,8只/组.腹腔注射干预:模型组RPMI 1640培养液0.2mL/d;地塞米松组,地塞米松溶液1mg/kg·d;商陆皂苷甲组,EsA溶液20mg/kg.d;每只小鼠1次/d,连续4周,处死小鼠取肾组织标本检测(终点为小鼠22周龄).干预始点及结束前,留取尿标本检测尿蛋白和尿肌酐浓度.[结果]与模型组相比,商陆皂苷甲组和地塞米松组尿蛋白/肌酐比值下降,肾脏病理变化有不同程度改善,肾组织中PCNA表达减弱,肾组织Caspase-3、Fas和FasL表达增强(P＜0.05).[结论]实验剂量EsA和地塞米松能够降低BXSB小鼠尿蛋白,改善肾脏病理变化;EsA和地塞米松减轻BXSB小鼠肾损害可能机制是通过抑制BXSB小鼠肾组织细胞增殖和促进肾组织细胞凋亡实现.
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商陆皂苷甲致肝毒性的研究
目的 通过体外、体内实验相结合的方法考察商陆皂苷甲所致的肝毒性.方法 MTT法测肝细胞(L-02细胞)活力;以不同质量浓度的商陆皂苷甲与肝细胞共培养后,测细胞培养上清中的AST(谷草转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶)和LDH(乳酸脱氢酶)水平,并在光镜下对细胞形态进行观察;Hoechst-PI双标染色观察细胞的凋亡和坏死情况;取KM种小鼠分为正常组和给药组,给药组的小鼠每天尾静脉注射10 mg/kg商陆皂苷甲,连续给药7d,考察小鼠血清肝功能指标和肝组织的病理学变化.结果 MTT的结果显示,商陆皂苷甲能显著抑制肝细胞活力,其IC50为360.18 μg/mL;400 μg/mL的商陆皂苷甲能升高细胞培养上清中的AST、ALP和LDH (P ＜0.01)并使肝细胞出现变圆、减少和死亡的现象;300和350 μg/mL的商陆皂苷甲能使肝细胞发生凋亡和坏死;体内实验表明,小鼠血清中的AST和ALT(谷丙转氨酶)水平均明显升高(P＜0.01),小鼠肝脏多出现肝细胞多发灶性坏死及肝细胞再生现象.结论 大剂量的商陆皂苷甲对肝脏具有一定的毒性作用.
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商陆皂苷甲对自身免疫综合征模型小鼠的疗效
目的:研究商陆皂苷甲(EsA)对自身免疫综合征模型小鼠的疗效.方法:采用ELISA、3H-TdR掺入和病理学检测3种方法,分别观察EsA对模型小鼠抗ds-DNA抗体水平、淋巴细胞转化水平及内脏炎症的影响.结果:EsA在5～20 mg/kg剂量范围内能降低模型小鼠升高的抗ds-DNA抗体和淋巴细胞转化水平,且能显著地改善模型小鼠内脏组织的炎症.结论:EsA对自身免疫综合征模型小鼠有显著的治疗作用,EsA有希望成为治疗自身免疫疾病的有效药物.
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陆皂苷甲对小鼠胸腺细胞凋亡的影响
目的:研究商陆皂苷甲(EsA)对小鼠胸腺细胞的凋亡效应的影响.方法:采用电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪三种分析方法,测定EsA对小鼠胸腺细胞的凋亡效应的影响.结果:EsA在2.5～10 μg/ml的浓度范围内,对小鼠胸腺细胞自发出现的细胞凋亡无影响,但能显著地促进ConA活化的胸腺细胞的凋亡.结论:EsA有促进ConA活化的胸腺细胞凋亡的作用,显示商陆皂苷甲对细胞免疫有调节作用.
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商陆皂苷甲对兔滑膜细胞产生IL-1和TNF的影响
目的：研究商陆皂苷甲（EsA）对脂多糖（LPS）刺激兔滑膜细胞产生白介素1（IL-1）和肿瘤坏死因子（TNF）的影响。方法：用胸腺细胞增殖法和用L929细胞作靶细胞的生物测定法，分别检测与EsA共育的受LPS刺激的兔滑膜细胞培养上清中IL-1和TNF的含量。结果：EsA在5～40 μg/ml范围内能明显抑制LPS诱导兔滑膜细胞产生IL-1和TNF。结论：EsA可抑制滑膜细胞产生IL-1和TNF的作用提示其可能有助于消除类风湿性关节炎的关节炎症。
