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补肾益智方含药血请对培养海马神经元过度凋亡的抑制作用
目的:探讨天然促智药复方--补肾益智方含药血清对培养海马神经元过度凋亡的抑制作用.方法:取补肾益智方治疗组及各对照组大鼠的血清进行海马神经元培养,荧光标记,计量分析.结果:各组血清培养的海马神经元凋亡率,中药组明显低于模型组、石杉碱甲(HupA)组明显高于青年组,与老年正常组没有明显差异.结论:补肾益智方含药血清可减少培养海马神经元的过度凋亡.
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丹酚酸B对大鼠皮层神经元缺糖缺氧损伤的影响
目的 探讨丹酚酸B(SalB)对原代培养大鼠皮层神经元缺糖缺氧损伤的影响.方法 采用原代培养的大鼠皮层神经元,随机分为正常组、模型组和丹酚酸B组,复制缺糖缺氧4 h的细胞模型,MTT法观察神经元的活性和存活率,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP)、细胞内游离Ca2+和细胞凋亡率.结果 丹酚酸B组神经元的活性(0.450±0.105)、存活率(58.20±13.56)%以及MMP荧光值(126.24±12.09)高于模型组神经元的活性(0.336±0.037)、存活率(43.40±4.73)%以及MMP荧光值(109.75±10.15),两者比较有明显差异(P<0.05);而丹酚酸B组LDH漏出率(15.84±1.47)%、细胞内Ca2+荧光强度(66.75±5.93)及凋亡率(4.82±2.48)%则低于模型组的LDH漏出率(27.39±3.75)%、细胞内Ca2+荧光强度(101.09±16.08)及凋亡率(10.83±2.13)%,两者相比亦有显著性差异(P<0.01).结论 丹酚酸B通过维持细胞内Ca2+稳态,稳定线粒体膜电位及降低细胞凋亡率,对缺糖缺氧损伤的大鼠皮层神经元起到保护作用.
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体外缺血/再灌注神经元DNA损伤的初步研究
目的和方法:应用胎鼠皮层细胞原代培养,建立神经元的体外“缺血/再灌注”模型,观察神经元缺血/再灌注后DNA链的损伤.应用PANT和TUNEL染色分别检测缺血/再灌注后DNA单链和双链损伤.结果:神经元缺糖缺氧2h引起极少量细胞死亡, h引起少于30%的细胞死亡,而6～8 h的缺糖缺氧引起的细胞死亡数量达到80%以上, h缺糖缺氧再灌注10～18h,细胞死亡达高峰,而在8 h缺糖缺氧再灌注2 h细胞死亡已经达高峰.在缺糖缺氧2,,6, h再灌注5min,ANT阳性细胞分别达30%,0%,0%,0%.而在同样的情况下,UNEL染色阳性细胞数没有明显增加.结论:体外神经元缺糖缺氧再灌注早期即出现DNA链的损伤,且以单链损伤为主.
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氨中毒对体外培养大鼠神经元GABAA受体亚单位mRNA表达的影响
目的 观察氨中毒对体外大鼠培养神经元GABAA受体亚单位mRNA表达的影响,探讨肝性脑病(HE)发病机制.方法 采用原位杂交技术,观察氨对体外培养新生大鼠神经元GABAA受体亚单位α1、β1及γ2mRNA表达的改变.结果 与对照组相比,氨中毒神经元GABAA受体亚单位α1(增幅18％,P＜0.05)、γ2(增幅23％,P＜0.01)的mRNA表达显著上升,亚单位β1的mRNA表达无明显改变.结论 氨可通过影响GABAA受体亚单位的表达发挥其对肝性脑病的致病作用.
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阿糖胞苷在大鼠皮质神经元细胞培养中的适宜介入时间
背景:由于中枢神经系统疾病研究需求,实验室常用有毒性的阿糖胞苷获得纯度较高的神经元细胞,然而阿糖胞苷的介入时间鲜见研究.目的:验证终浓度为10μmol/L阿糖胞苷在大鼠皮质神经元原代细胞培养中的适宜介入时间.方法:采用神经元专用培养基Neurobasal+B27进行大脑皮质组织原代神经元培养,分别于接种细胞后12,24,36,48 h加入终浓度为10μmol/L阿糖胞苷.每48 h半量换液.于7 d后倒置的显微镜下观察神经元形态;采用免疫细胞化学的方法对神经元特异性烯醇化酶进行免疫化学染色,鉴定神经元细胞的纯度和成熟度;计算机多功能图像分析系统对所有神经元特异性烯醇化酶阳性细胞进行形态学计量分析.结果与结论:①接种细胞后24 h加入阿糖胞苷,神经元纯度在90%以上,分化成熟神经元细胞占比89.00%,神经元细胞胞体面积大,突触长,胞质透亮,核大而明显,细胞体周围折光性强,立体感强,突起三四个,具有三四级分叉,形成良好的网络结构,非神经元细胞较少,神经元纯度及细胞状态佳;②结果表明,阿糖胞苷介入培养过程越早,神经元细胞纯度越高,但阿糖胞苷对神经元细胞分化成熟的影响也会越明显;采用neurolbasal培养基,于接种细胞后24 h加入阿糖胞苷,可以获得理想纯度,成熟度较好,生长状态较好的大脑皮质神经元.
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NGF对新生大鼠小脑皮质神经元凋亡的影响
目的研究NGF对新生大鼠小脑皮质神经细胞凋亡的影响.为其临床治疗小脑变性疾病奠定理论基础.方法用原代培养的大鼠新生乳鼠小脑皮质细胞建立谷氨酸诱导的神经细胞凋亡模型,实验组的各组提前24h加入NGF,模型组不给NGF,并观察NGF的保护作用.通过检测培养液LDH含量,反映细胞的代谢情况和细胞功能和状态,通过流式细胞仪检测DNA的含量,定性的反映细胞凋亡率.结果谷氨酸(Glu)500μmol@L-1与细胞作用时间5min可诱导细胞凋亡.取细胞培养液检测LDH的浓度明显增高,流式细胞仪检测显示,在G1峰前出现一个"G1亚峰"凋亡细胞,所占比例为50.2%及45.7%.NGF(50,100μg@L-1)能够使LDH(乳酸脱氢酶)的含量减低,凋亡细胞数减少.结论NGF能拮抗兴奋性氨基酸诱导神经细胞凋亡.
关键词： 神经生长因子(NGF) 神经元培养 凋亡 小脑皮质 -
分子血红蛋白对培养胎鼠脊髓神经元的毒性及其机制研究
目的探讨分子血红蛋白(MHb)的生物活性,为该类血液代用品在脑复苏领域的应用提供理论依据.方法采用12～15d胎鼠脊髓神经元进行原代分散培养,观察1、10、50μmol/L不同浓度MHb对神经元形态和活性的影响.结果作用24h时各实验组脊髓神经元均观察到毒性反应,神经元活性也明显低于空白对照组(P<0.01).超氧化物歧化酶(SOD)和甘露醇能够抑制MHb的毒性作用.结论氧自由基介导了MHb对脊髓神经元的毒性作用,提示对MHb进行修饰来防止自由基生成的必要性.
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血小板活化因子介导神经元损伤与天门冬氨酸信号通路的研究
目的探讨血小板活化因子(PAF)诱导的神经元凋亡是否涉及N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)信号传导通路.方法用原代小鼠大脑皮质神经元培养系统,不同剂量PAF处理神经元24 h或PAF受体拮抗剂(BN 52021)、NMDA受体拮抗剂(MK-801)和一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)预处理30 min;碘化物(PI)/calcein(钙黄绿素)染色,荧光显微镜摄像,计算细胞死亡率.同时免疫印迹蛋白测定神经型一氧化氮合成酶(nNOS)表达水平及用3H标记放免法检测nNOS的活性.结果 (1)不同剂量(0.01、0.1、0.3、0.6 μmol/L)的PAF处理神经元24 h,均可致神经元死亡,0.3和0.6 μmol/L组与对照组相比,差异均有显著性(均P<0.01).(2)PAF神经毒性作用不仅被BN 52021所拮抗,MK-801、L-NAME也可减轻其作用.(3)PAF增加神经元的nNOS蛋白的表达,同时也增加其活性.结论 PAF对神经元的损伤作用与NMDA信号通路激活有关.
关键词： 血小板活化因子 神经元培养 神经毒性 N-甲基-D-天门冬氨酸 -
新生Long Evans大鼠初级视皮层神经元的培养和鉴定
目的 建立新生Long Evans大鼠视皮层神经元原代培养方法.方法 采用钝性分离1d龄Long Evans大鼠双侧视皮层,2.5 g· L-1胰蛋白酶消化法获得细胞悬液,在无血清培养基中进行培养,7～14d后行免疫组织化学及膜片钳鉴定.结果 用该方法培养的视皮层神经细胞存活率高,生长状态良好,存活可达1个月左右,β-Ⅲ tubulin免疫组织化学染色阳性神经元占培养细胞中的80％以上,膜片钳成功记录了180个细胞,静息膜电位在- 50 ～ - 70 mV,存在内向、外向电流,脉冲恒流刺激可诱发多个动作电位.结论 本研究所采用的分离及原代培养方法是一种简单、高效的视皮层神经元培养方法.
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氦-氖激光对体外培养神经元生长发育与存活的影响
目的研究氦-氖激光照射对培养神经元生长发育、存活及衰老的影响.方法采用氦-氖激光照射无血清培养基培养的神经元,观测其生长发育、存活、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等的变化.结果氦-氖激光照射可促进神经元生长及其网络形成、存活时间延长、增加SOD含量和减少MDA生成.结论氦-氖激光照射可促进神经元发育、延缓神经元衰老及增强神经元的抗氧化能力.
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海马神经元原代培养与纯度鉴定方法的优化
目的:通过优化和改进传统的神经元培养方法,探讨一个简单、高纯度的大鼠胚胎海马神经元的原代培养及活性检测方法.方法:颈椎脱臼处死孕鼠,迅速取海马,剥离血管网等结缔组织后,消化并吹打制成细胞悬液,以适当的密度接种入DMEM/HG培养基,4h后换用Neurobasal培养基,以后每2-3 d进行1/3量换液.倒置显微镜观察神经元的形态变化,并采用CCK-8试剂盒检测神经元活性和神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定神经元纯度.结果:细胞接种4h后贴壁,随着培养时间的延长神经元的形态发生一系列变化,从圆形、透亮、体积小逐渐变为椭圆形、三角形或椎形,有光晕,胞体增大,突起伸长且分支增多,在培养第4天后逐渐连接呈网络状.神经元纯度随时间的延长逐渐升高,培养第7天纯度高达90％以上.神经元在培养的第9、10天达到成熟,即可用于后续研究.结论:本实验方法简便易行,神经元纯度高、细胞活性好,体外存活时间长,是体外研究的良好实验模型,值得推广应用.
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CBD和尼莫地平对培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用
目的 研究一种神经营养物质CBD和尼莫地平（Nimodipine，Nim）联合应用对培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用。方法 分别采用谷氨酸化学或机械划痕创伤性损伤培养大鼠皮层神经元，根据培养细胞台盼蓝活力计数和培养上清乳酸脱氢酶（LDH）检测评估损伤程度。结果 CBD和Nim单独应用时，对谷氨酸和创伤介导的培养皮层神经元损伤有中等程度的保护作用，与单独损伤未加保护性药物组相比较有显著性差异（P<0.01）。CBD和Nim联合会用时，保护作用比单独应用明显增强（P<0.01）。结论 CBD和Nim联合应用有明显的协同作用。
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PTEN表达下调对神经元胞内游离钙离子和神经元凋亡的研究
目的:探讨神经元缺血缺氧损伤再灌后,下调PTEN在阻断Ca2+内流及凋亡调控方面的保护机制.方法:建立神经元缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤模型,转染shRNAspten-GFP质粒,用Western blotting检测PTEN水平,Fura2-AM法测定胞内Ca2+浓度,流式细胞术和AO/EB检测神经元凋亡.结果:与正常组相比OGD后细胞凋亡率和胞内Ca2+浓度显著升高(P＜0.05);与对照组相比经shRNAspten干预后胞内Ca2+浓度和细胞凋亡率明显降低(P＜0.05).结论:shRNAspten-GFP能成功转染到神经元中,PTEN表达下调可阻断Ca2+内流并对缺糖缺氧诱导的细胞凋亡有拮抗作用,从而达到神经元保护的目的.
关键词： PTEN shRNAspten-GFP质粒 游离钙 凋亡 神经元培养 -
培养大鼠皮层神经元缺氧损伤与蛋白激酶活化关系的研究
目的检测神经元缺氧后膜性PKA(蛋白激酶A)和PKC(蛋白激酶C)活性变化,以及它们的特异性抑制剂对神经元凋亡率的影响.方法建立培养的神经元"缺血"模型,然后用不同浓度的特异性PKA抑制剂Rp-cAMP和特异性PKC抑制剂Calphostin C预孵育培养神经元再进行"缺血"实验,用放射酶分析法测定神经元缺氧后的膜性蛋白激酶活性,各组缺氧神经元的凋亡百分率由TUNEL荧光试剂盒测定.结果随着神经元缺氧时间的延长,神经元膜性PKA和PKC活性均增加;随着Calphostin C浓度的增加,细胞凋亡率显著增加;相反随着Rp-cAMP浓度的增加,细胞凋亡百分率显著减少.结论①PKA和PKC信号转导通路均参与了缺氧神经元损伤;②缺氧后培养神经元PKA和PKC对凋亡的调控功能相反,提示在培养的缺氧神经元中PKA和PKC信号转导属于单相控制系统,可能二者在细胞中的比例决定着缺氧神经元的存亡.
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谷氨酸对体外培养大鼠神经细胞毒性机理的研究
为进一步探讨谷氨酸(Glu)的神经毒性机理,采用体外培养大鼠大脑皮质神经细胞12～14天,再分别加入Glu(Glu组),Glu+尼莫地平(拮抗剂Ⅰ组),Glu+MK-801(拮抗剂Ⅱ组),检测各组神经细胞胞浆总钙(TCa)及游离钙(Ca2+i).结果显示:Glu组TCa和Ca2+i明显高于正常对照组(P＜0.05),拮抗剂Ⅰ、Ⅱ组TCa、和Ca2+i均高于正常对照组(P＜0.05)而低于Glu组(P＜0.05).提示:谷氨酸通过Ca2+电压通道和受体依赖通道的激活,导致细胞内Ca2+i沉积而产生神经毒性.
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二次分层离心纯化成年大鼠背根节神经元的方法
目的:建立一种长时程的有效获得高度纯化成年大鼠背根节(dorsal root ganglions,DRG)神经元的方法.方法:将SD大鼠的DRG剥膜、消化制成单细胞悬液,牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)分层离心去除大部分非神经元细胞后接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片上;培养1d后,胰酶消化再次制成细胞悬液,BSA二次分层离心,再次接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片上.BSA二次分层离心后的神经元为实验一(T1组)、单次离心的神经元为实验组二(T2组)、未经离心处理的神经元为对照组(C组).各组除离心次数外,其余各方法相同.相差显微镜下观察上述各组培养神经元,结合βtubulinⅢ免疫荧光组化染色及MTT分析检测神经元纯化效果及细胞活力.结果:培养3d后,T1组神经元比例达88.43±6.13％,较T2组、C组显著增高,差别具有统计学意义(P＜0.05);MTT的结果显示与T2组、C组比较,T1组神经元的相对活力略微下降,但无统计学差异(P＞0.05).结论:二次纯化法是一种简单有效的成年大鼠DRG神经元纯化方法.
