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FDA生物分析方法确证的发展与动态
美国制药学会(AAPS)联合美国食品药品监督管理局(FDA)分别于1990年、2000年以及2006年召开了3届生物分析方法研讨班,在前两届研讨班的基础上,FDA于2001年出台了一份正式的生物分析方法指导原则.回顾和阐述生物分析方法在近20年取得的发展和进步,为牛物分析方法具体应用到动物或人体的生物利用度、生物等效性以及药代动力学研究提供指导和建议.
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乙腈辅助电喷雾LC-MS/MS法分析头孢克肟中的有关物质
目的:建立LC-MS/MS法分析头孢克肟中的有关物质.方法:采用Liehrospher ODS-2(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,以1%甲酸水溶液一乙腈(90:10,A)-乙腈(B)为流动相1.0 mL·min-1梯度洗脱分离;柱后分流,80%流出液PDA检测,20%流出液经添加0.2 mL·min-1乙腈辅助电喷雾离子化MS测定.采集有关物质的PDA谱、质谱母离子及子离子谱,并进行解析推测有关物质的结构.结果:在所建立的条件下,头孢克肟及其有关物质分离良好,检测出21个有关物质,对其中18个进行光谱解析;多种口服制剂中有关物质的种类和含量均较原料药有所增加.结论:建立的方法能有效地分离鉴别头孢克肟中的有关物质,为头孢克肟质量控制和工艺优化提供了参考.
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LC-MS/MS测定大鼠大黄素血药浓度及脑组织含量
目的:建立液相色谱一串联质谱(LC-MS/MS)方法,对虎杖主要药效成分大黄素在大鼠体内的药代动力学及在脑组织分布的经时变化进行研究,以探讨虎杖药材在大鼠体内的作用规律.方法:采用LC-MS/MS方法,色谱柱:Eclipse Plus-C18柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相:5 mmol·L-1醋酸铵溶液-乙腈(1:1,v/v),流速:0.2 mL·min-1.ESI离子源,负离子扫描模式,多反应离子检测模式:母离子和子离子的m/z分别是269.2和181.9,检测生物样品中的大黄素含量.结果:血浆大黄素在0.03～6 μg·mL-1范围内呈良好的线性,线性相关系数0.9989,高、中、低浓度绝对回收率87.8%～120.3%,相对回收率为95.9%～117.2%;脑组织大黄素在5.0～1000 ng·g-1范围内呈良好的线性,线性相关系数0.9999,高、中、低浓度绝对回收率94.1%～97.2%,相对回收率99.1%～103.1%.大黄素在大鼠体内药代动力学模型符合二房室模型.结论:该方法对大黄素测定具有良好的灵敏度、准确度、精密度以及专属性,完全适应于生物样品中微量大黄素的浓度测定.
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鱼腥草药材挥发油及其注射剂中癸酰乙醛的研究考证
目的:对鱼腥草药材挥发油及其注射剂中抗菌成分癸酰乙醛是否存在进行研究考证.方法:采用LC-MS/MS的一级质谱全扫描、选择性离子检测和子离子扫描方式对癸酰乙醛进行分析确证,以GC-MS和GC-FID进行佐证.结果:多种分析手段一致确证了鱼腥草药材挥发油中含有癸酰乙醛,而注射剂中却未检出.结论:鱼腥草注射液现有生产工艺和产品标准仅对化学成分甲基正壬酮进行分析控制,没有对挥发油中具有药理活性的癸酰乙醛进行测定控制,有待改进.
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LC-MS/MS法测定大鼠脑组织中单胺类神经递质及代谢产物
目的:建立LC-MS/MS法测定大鼠脑组织中5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)、3,4-双羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)的含量.方法:采用Ther-mo C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm),柱温为室温;水(含0.05%的甲酸)-乙腈为流动相,流速为0.8 mL·min-1.ESI+多个反应监测(MRM)模式监测反应质荷比(m/z):177.06→159.92(5-HT),170.00→152.00(NE),154.00→137.00(DA);ESI-多个反应监测(MRM)模式监测反应质荷比(m/z):190.00→145.90(5-HIAA),263.00→165.00和263.00→150.00(MHPG),166.90→122.80(DOPAC),180.70→136.60(HVA).结果:5-HT、NE和DA分别在4.45～4450 ng·mL-1、4.11～4110 ng·mL-1和4.10～4100 ng·mL-1浓度范围内线性良好(r≥0.999),低检测浓度分别为4.45,4.11,4.10 ng·mL-1;5-HIAA、MHPG、DOPAC和HVA在12.5～1000 mg·mL-1浓度范围内线性良好(r≥0.998),低检测浓度为12.5 ng·mL-1.日内和日间RSD均小于8.5%,重复性好.结论:本方法灵敏、快捷、准确、专一性强,可用于神经精神疾病神经递质的研究与分析.
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LC-MS/MS法测定人血清中茴三硫代谢产物的浓度
目的:建立测定体内茴三硫代谢产物对羟基苯基三硫酮的液相色谱-串连质谱(LC-MS/MS)方法.方法:血清样品中加入内标消炎痛,直接沉淀法处理样品.色谱柱为Gemini C18(50 mm×2.0 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.02%氨水(43:57,pH=8),流速为0.3 mL·min-1.采用HPLC-ESI-MS法,MRM扫描方式,用于定量分析的离子反应分别为m/z 225.0→159.8(对羟基苯基三硫酮)和356.3→312(内标,消炎痛).结果:对羟基苯基三硫酮的线性范围为2.5～500 ng·mL-1,低定量浓度为2.5 ng·mL-1,提取回收率火于95%,日内、日间RSD分别为3.6%～7.2%及6.5%～8.9%,准确度为92.2%～103%.结论:本方法样品预处理快速简便,检测灵敏、准确、专一,适用于进行茴三硫体内药动学的研究.
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LC-MS/MS法测定人血清中比卡鲁胺含量
目的:建立测定人血清中比卡鲁胺浓度的LC-MS/MS法.方法:血清样品采用乙腈沉淀蛋白处理,取上清液进样.以甲醇-水(70:30,v/v,含5 mmol·L-1的甲酸铵,并用氨水调pH 7.96)为流动相;在ZORBAX SB-C18(300 mm×150 mm.3.5μm)色谱柱分离;以戊巴比妥钠为内标.流速0.4 mL·min-1;柱温20℃;进样量5 μL.采用电喷雾电离源(ESI),MRM负离子检测模式,选择性监测比卡鲁胺(m/z 429/255),内标戊巴比妥钠(m/z 225/182).结果:比卡鲁胺的保留时间约为3.2min;线性范围为10～2000 ng·mL-1.批内和批问的RSD均小于7.0%;回收率均在90%以上.结论:该方法预处理快速简单,灵敏度高,专一性强,可用于比卡鲁胺的药动学研究及临床血药浓度监测工作.
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用LC-MS/MS法测定人血浆中的氢氯噻嗪及其药动学研究
目的:建立人血浆中氢氯噻嗪浓度测定的LC-MS/MS法,进行人体药动学研究.方法:测定20名健康受试者口服受试制剂(单剂量、多剂量)后血浆中氢氯噻嗪浓度.结果:单剂量口服氢氯噻嗪(12.5,25 mg)后药动学参数:T1/2β为(13.57±2.39)、(10.93±1.71)h;Tmax为(1.85±0.53)、(2.20±0.59)h;Cmax为(74.14±15.04)、(125.57±23.47)μg·L-1;AUC0-48为(470.0±90.7)、(794.7±182.6)μg·h·L-1;氢氯噻嗪多剂量(12.5 mg,qd)药动学参数:Tss/max为(1.83±0.25)h,Cssmax为(80.21±17.98)μg·L-1,Css/min为(3.72±1.79)μg·L-1,Cav为(19.37±3.20)μg·L-1,AUCss0-48为(464.90±76.89)μg·h·L-1.结论:本方法灵敏度高,结果准确,氧氯噻嗪在大部分人体内的过程符合二室开放模型,其主要药动学参数与国内外文献相近.
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LC-MS/MS法测定人血浆中地氯雷他定及其代谢产物3-羟基地氯雷他定的浓度
目的:建立LC-MS/MS法测定人血浆中地氯雷他定及其主要代谢产物3-羟基地氯雷他定的浓度.方法:血浆样品经碱化后用乙醚提取,采用液相色谱-质谱联用法检测.色谱条件为分析柱CAPCELL PAK C18(50 mm×2.0 mm,5μm),预柱Octadecyl C18(4.0 mm×3.0 mm);流动相:甲醇-乙腈-5 mmol·L-1甲酸铵水溶液(30∶20∶50);流速0.2 mL·min-1;柱温40℃;进样量10 μL.质谱条件为电喷雾离子源(ESI),正离子扫描;选择性监测质荷比(m/z)为311.1/259.1(地氯雷他定),327.1/275.1(3-羟基地氯雷他定),315.1/263.1(D4-地氯雷他定,内标),331.1/279.1(D4-3-羟基地氯雷他定,内标)带正电荷的分子离子峰.结果:地氯雷他定、3-羟基地氯雷他定的线性范围均为0.05～10.0 ng·mL-1,定量下限均为0.05 ng·mL-1,批内、批间RSD均小于10%.结论:该方法简便,灵敏度高,专属性强,可用于地氯雷他定及其代谢产物的临床药动学和生物等效性研究.
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LC-MS/MS测定裂解流感疫苗中的去氧胆酸残留量
目的:建立流感疫苗中去氧胆酸残留量的LC-MS/MS测定方法.方法:采用液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱仪,多离子反应监测(MRM)定量法.用胆酸作内标,通过对试样净化预处理、色谱条件、质谱参数等的优化选择和方法回收率、精密度等的验证,建立了定量测定流感疫苗中去氧胆酸残留的理想方法.结果:方法检出限为0.005 mg·L-1,定量限为0.010 mg·L-1,在0.005～100 mg·L-1线性范围内,相关系数r为0.9998,回收率大于98.0%,方法精密度RSD小于4.0%(n=6).结论:采用液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱仪,可快速测定流感疫苗中的去氧胆酸,结果准确可靠,重复性好,灵敏度高,建立的方法可以准确测定流感疫苗中去氧胆酸的残留量.
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茶多酚的指纹图谱和主要成分的含量测定方法研究
目的:建立茶多酚的HPLC指纹图谱检测方法.方法:采用ODS柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相A:甲醇-0.1%甲酸溶液(10∶90),流动相B:甲醇-乙腈-0.1%甲酸溶液(50∶30∶20),进行梯度洗脱:0 min(0%B)→10 min(10%B)→30min(20%B)→40 min(30%B)→45 min(40%B)→55 min(50%B);流速1 mL·min-1;检测波长280 nm.并对主要成分峰进行LC-MS/MS鉴定.结果:茶多酚HPLC指纹图谱中有11个特征成分峰,经对照品对照及液质联用鉴定了其中9个成分,分别为表儿茶素(EC)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和咖啡因(CAF).结论:HPLC指纹图谱可以对茶多酚中主要特征有效成分进行准确的定性与定量测定,色谱系统稳定,适用性良好.
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LC-MS/MS法测定全血中瑞芬太尼含量
目的:建立液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定全血中瑞芬太尼的含量.方法:抗凝全血经乙腈直接沉淀后,以液相色谱分离、电喷雾离子化串联质谱进行检测,瑞芬太尼、利伐司替明(内标)的MRM扫描离子通道m/z分别选择为377.6→317.0和251.6→206.1,瑞芬太尼的保留时间为1.64min,每个样品分析用时3.0 min.结果:瑞芬太尼在0.0625～8 ng·mL-1范围内线性关系良好(r=0.9978).日内、日间RSD分别为1.4%～7.4%及4.5%～14%,准确度分别为95.6%～102.1%及94.4%～102.6%.结论:该方法的样品预处理快速简便,检测专一灵敏,可满足瑞芬太尼临床研究药物浓度测定的要求.
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LC-MS/MS法测定人血浆中兰索拉唑及其代谢产物的浓度
目的:建立测定人血浆中兰索拉唑及其代谢产物浓度的LC-MS/MS法.方法:色谱条件为Diamonsil C18(250mm×2.1 mm,5μm),Octadacyl C18(4.0 mm×3.05mm)预柱;流动相:乙腈-2 mmol·L-1醋酸铵溶液(60:40,含0.1%甲酸);流速0.2 mL·min-1;柱温40℃;进样量10 μL.质谱条件为电喷雾电离源(ESI-),选择性监测质荷比(m/z)为368.1/164.1(兰索拉唑),384.0/180.0(5-羟基兰索拉唑),384.0/115.9(兰索拉唑砜),364.1/188.8(吲达帕胺,内标)带负电荷的分子离子峰.样品用沉淀蛋白法处理.结果:兰索拉唑、5-羟基兰索拉唑、兰索拉唑砜的线性范围分别为10～5000,1.0～500,1.0～500ng·mL-1;定量下限分别为10,1.0,1.0mg·mL-1;提取回收率均在80%以上;批内、批间的RSD均小于15%.结论:该方法的血样处理过程简便、灵敏度高、专一,可用于兰索拉唑及其代谢产物的临床药动学研究.
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建立液相与串联质谱联用(LC-MS/MS)测定拉米夫定的方法
目的:建立一个测定人血浆中拉米夫定的浓度的灵敏、快速的高效液相与串联质谱联用(LC-MS/MS)的方法.方法:液相条件:采用J'sphere ODS C18(2.0 mm×150mm)色谱柱;流动相:甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵(pH 4.2,30:70);流速:0.2 mL·min-1.串联质谱条件:采用多反应离子监测(MRM)检测,每个样品分析用时4 min.结果:在10-2000 ng·mL-1范围内,标准曲线r值均在0.995～1.000之间;低检测浓度为10 ng·mL-1;日内、日间的RSD皆小于15%;准确度皆在85%-115%范围内.结论:本方法简单、快速、灵敏、准确,可用于人血浆中拉米夫定浓度的检测.
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莪术醇对照品的主要有关物质分析
目的:鉴定化学对照品莪术醇中的主要有关物质.方法:采用LC-MS/MS联用法,以SHIMADZU VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱,乙腈-0.1%醋酸溶液(85:15)为流动相,以APCI为离子源,采用一级、二级质谱全扫描方式,对莪术醇对照品中的有关物质进行色谱分离及质谱鉴定.结果:通过对分子质量、二级质谱碎片信息和液相保留时间三方面信息,与对照品比较,证明莪术醇对照品中的有关物质为异莪术烯醇.结论:为莪术醇对照晶的标化和提纯提供了依据.
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Chiralcel OD-H手性柱液相色谱串联质谱法同时拆分4个β-受体阻滞剂
目的:建立手性固定相液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)同时分离4个β受体阻滞剂的方法.方法:以Chiralcel OD-H(250 mm×4.6 mm,5μm)为手性柱,通过电喷雾离子化(ESI),采用多反应检测(MRM)方式进行正离子检测,普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔检测离子分别为m/z 260.2→116.0,m/z 268.4→116.0,m/z 267.2→145.0,m/z 326.2→116.0,在23 min内同时完成4个对映体的分离.结果:考察了流动相组成、柱温及流速对拆分的影响,并优化了实验条件,终获得同时分离4个β受体阻滞剂的LC-MS/MS方法.针对药物的结构特点和固定相的种类,探讨了手性分离机理.结论:本方法很大程度上提高了分离效率,具有简便、高效及重复性好等特点,可用于该类药物的常规及生物样品分析.
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吐根酊特征图谱研究与质量评价方法建立
目的:建立吐根酊的HPLC特征图谱,对主要成分进行鉴别,并评价其质量.方法:采用Inertsil ODS-SP(250 mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.4％甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速为1 mL·min-1,检测波长210 nm,柱温35℃.利用LC-MS/MS方法对特征图谱中的主要特征峰进行推测,对其中的主要未知峰进行液相制备纯化,并用NMR试验进行结构鉴定.结果:建立了40批吐根酊的HPLC特征图谱,推测其中的6个特征峰,对3个含量较大的色谱峰进行准确指认,分别为吐根酚碱、吐根碱和吐根苷.判断其中36批吐根酊样品为合格样品,4批为劣质吐根酊样品.结论:建立的吐根酊HPLC特征图谱专属性强,方法验证表明其可用于该产品的质量评价.
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在线固相萃取LC-MS/MS法测定人全血中依维莫司浓度的不确定度评定
目的:评定在线固相萃取LC-MS/MS法测定人全血中依维莫司浓度的不确定度.方法:对全血依维莫司浓度测定过程中各影响因素,包括测定精密度、称量、对照品溶液的配制、标准含药全血样品的配制、在线固相萃取、仪器、标准曲线拟合等进行分析评定,用A类评定程序评价了分析过程中随机效应引起的不确定度,用B类评定程序评价了分析过程的其他因素引起的不确定度,后根据各分量计算出合成不确定度并进行了扩展计算各变量的不确定度和合成不确定度,终计算扩展不确定度.结果:人全血中低(0.520 ng· mL-1),中(4.99 ng·mL-1),高(84.99 ng·mL-1)质量浓度依维莫司的扩展不确定度分别为0.056、0.40、7.16 ng·mL-1(P=95％,k=2).结论:在线固相萃取LC-MS/MS法测定人全血中依维莫司浓度的不确定度主要由提取回收率(尤其是低浓度)、对照品溶液配制、仪器允差及测定精密度引入.
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LC-MS/MS同时测定曲美布汀和活性代谢物在Beagle犬体内的血药浓度及其药代动力学研究
目的:建立灵敏稳定的HPLC-MS/MS方法,用于测定Beagle犬血浆中的曲美布汀(TM)及N-去甲基曲美布汀(NTM)含量,并研究曲美布汀片剂在健康Beagle犬体内的药代动力学.方法:样品处理采用液液萃取方法,选择西布曲明(IS)为内标.进行HPLC-MS/MS分析,采用ESI源,MRM离子检测模式,TM、N-TM和IS的检测离子对分别为m/z 388.2→343.2,m/z 374.2→195.2,m/z 280.3→125.1.单剂量给药300 mg后,测定犬血浆中TM及N-TM的浓度,并计算药代动力学参数.结果:血浆中TM及N-TM检测的线性范围分别为1～500 ng·mL-1(r=0.9959),0.2 ～100 ng·mL-1(r =0.9951),萃取回收率均高于85％,日内、日间RSD均小于10％.犬血浆中TM及N-TM Cmax分别为(192±32.1 )ng·mL-和(47.1±22.6) ng·mL-1,Tmax均为(0.667±0.258)h和(1.08±0.492)h,T1/2分别为为(10.8±4.27)h和(7.06±2.53)h.结论:该方法可简便、高效地测定犬血浆中TM及N-TM浓度,并应用于药代动力学研究.
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LC-MS/MS法同时测定Beagle犬血浆中阿托伐他汀钙和盐酸吡格列酮的浓度
目的:建立LC-MS/MS方法测定Beagle犬血浆中阿托伐他汀钙和盐酸吡格列酮的浓度,并验证方法.方法:采用蛋白沉淀法提取血浆中药物,以地西泮为内标;使用Shim-pack XR-ODS(2.0 mm×100 mm,2.2 μm)色谱柱,Shim-pack GVP-ODS(2.0 mm×5 mm,2.2 μm)保护柱,柱温40℃;流动相A为5 mmol·L-1醋酸铵(pH 5.55),B为乙腈,采用梯度洗脱(0～0.6 min,10％ B;0.6 ～ 1.2 min,10％→90％B;1.2～3.5 min,90％B;3.5～4.1 min,90％→10％B,5.5 min结束);流速为0.3 mL.min-1;进样体积20 μL.质谱均采用电喷雾离子源(ESI),以多反应离子监测(MRM)模式进行定量分析.结果:阿托伐他汀钙、盐酸吡格列酮分别在0.05 ～ 50、0.5～ 1000 ng·mL-1范围内有良好的线性关系,低检测限分别为0.05、0.5 ng·mL-1,日内、日间精密度RSD均＜15％(n=5).含药血浆室温放置24 h、处理后4℃放置24h、反复冻融3次及-70℃下放置2个月稳定.结论:本方法简便、准确,能用于Beagle犬血浆中阿托伐他汀钙、盐酸吡格列酮的药物浓度测定和药动学研究.
