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硒蛋氨酸对食管癌细胞株增殖的影响
本研究的目的是观察硒蛋氨酸对体外培养食管癌细胞系(EC9706)生长的影响,以探讨其对食管癌的防治作用.
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外源性三磷酸腺苷对人食管癌Eca-109和肝癌SMMC-7721细胞增殖和周期的影响
目的 研究三磷酸腺苷(ATP)对于人食管鳞癌Eca-109细胞系和人肝癌SMMC-7721细胞系的抗增殖作用和作用机制.方法 用MTT法测定肿瘤细胞的增殖,AO/EB双荧光染色法观察细胞形态学的改变,流式细胞仪定量检测细胞增殖周期、凋亡率及凋亡相关蛋白的改变.结果 ATP在0.01～0.3 mmol/L浓度范围内,可不同程度地抑制Eca-109和SMMC-7721细胞的增殖.细胞分别经0.3 mmol/L的ATP处理72 h后,少量SMMC-7721细胞形态出现了凋亡特征,而Eca-109细胞无明显凋亡特征;ATP 0.03、0.1和0.3 mmol/L分别处理细胞72 h后,两株细胞的凋亡率及凋亡相关蛋白均无显著变化.ATP0.3 mmol/L可使Eca-109细胞的G0/G1细胞数目显著增多,S期细胞显著减少,增殖指数显著降低.结论 ATP通过增加G0/G1期细胞和减少S期细胞,抗食管癌Eca-109细胞增殖,此作用与诱导细胞凋亡无关.而ATP对肝癌SMMC-7721细胞的抗增殖作用与周期无关.
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电离辐射对食管癌细胞系(ECA109和TE13)r-H2AX表达的影响
维持一个完整的基因组对于细胞的稳定性是至关重要的,由电离辐射和类辐射药物产生的DNA双链损伤是主要的细胞毒损伤,如果不能修复这种损伤就会导致基因组不稳定和肿瘤的形成或其他年龄相关疾病[1].体内外的研究都证明H2AX的修饰在调节各种细胞应答DNA双链断裂中起着中心作用[2-4].Giunta等的实验为rH2AX作为DNA双链断裂的标志提供了证据[5].而食管癌ECA109为高分化鳞状细胞癌,TE13细胞为低分化鳞状细胞癌,他们的生物学特征不同,研究r-H2AX在不同食管癌株系的动力学特点将有助于了解DNA双链断裂——这一细胞内致命的损伤的特点与食管癌放疗敏感性之间的关系.
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建立十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系的核型
目的:应用12色荧光原位杂交技术(multicolor fluorescence in situ hybridization,M-FISH)鉴定食管癌细胞系KYSE450的染色体畸变.方法:采用DOP-PCR(degeneeate oligonucleotide primer-polymerase chain reaction)法混合标记两组多色painting探针,先后两次杂交到相同的KYSE450染色体片,结合反相DAPI显带技术进行核型分析.结果:成功地建立了一种重复的12色荧光原位杂交技术,并鉴定出KYSE450中存在的畸变染色体.该细胞系共有54条染色体,只有13,21和X号染色体是正常的,其余21条染色体均表现异常.1,2,3,5,6,8,9,14,15,16和17号染色体部分区带增益,4和18号染色体部分区带缺失.7,11,12和19号染色体同时存在区带增益和其它部分区带缺失.1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17,18和19号染色体显示有易位.22号染色体丢失1条,未检测到10,20,Y染色体成分.结论:12色荧光原位杂交可用于鉴定肿瘤中复杂的染色体异常.KYSE450存在较多与原发性食管鳞癌一致的染色体改变.
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miR-451对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响
目的:探讨miR-451对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响.方法:化学合成miR-451 mimics,脂质体包裹转染EC9706细胞为miR-451组,同时设立无关序列(Scramble-miR)对照组、脂质体对照组和空白对照组.转染后48 h,荧光定量RT-PCR检测miR-451表达量的变化,Western blot检测Bc1-2、AKT和磷酸化AKT蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变;MTT法检测转染后1、2、3、4、5、6d各组细胞增殖率.结果:miR-451组的miR-451表达水平显著上调(P＜0.01,F=69.26),为空白对照组的15.84倍;miR-451组细胞Bc1-2、AKT和磷酸化AKT蛋白表达均显著下调(P＜0.05,F=5.83)；miR-451组细胞凋亡率为12.07％±1.12％,与3个对照组比较显著升高(p＜0.01,F=26.72)；miR-451组平均侵袭细胞数为47.4±7.4,与3个对照组比较显著降低(P＜0.01,F=34.55).miR-451组细胞的生长在转染后2d出现显著抑制(P＜0.05,F=5.95),并且随时间的延长而日益显著.结论:上调miR-451表达可抑制食管癌EC9706细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡.
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硒蛋氨酸对食管癌细胞株增生的影响
目的:探讨硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC9706增生的影响.方法:通过MTT比色法、细胞生长曲线描绘研究硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC9706增生的影响,采用流式细胞仪观察硒蛋氨酸诱导EC9706细胞凋亡的作用及对细胞周期的影响.结果:硒蛋氨酸呈时间、剂量依赖性方式抑制EC9706细胞增生,改变细胞周期分布,增加G0/G1期细胞比例,诱导细胞凋亡.结论:硒蛋氨酸可能通过影响细胞周期分布和诱导细胞凋亡,来抑制EC9706细胞增生.硒蛋氨酸可能是预防和治疗食管癌的一种新方法.
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NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建
目的:克隆NGAL基因的cDNA,并构建其表达载体.方法:应用RT-PCR技术,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的cDNA,并重组到中间载体pT-Adv中,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列.然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA 3和原核表达载体pGEX-4T-3中.结果:获得了NGAL基因的cDNA全序列,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA-NGAL(+/-)和原核表达载体pGEX-NGAL,并在大肠埃希菌TOP10F＇中成功地表达出NGAL融合蛋白.结论:为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具.
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慢病毒介导RNF2基因表达对食管癌细胞X线照射后增殖与迁移等影响
目的 利用RNA干扰技术抑制人食管癌细胞中RNF2基因表达,观察其X线照射对细胞增殖活性、迁移能力、凋亡和细胞周期的影响.方法 培养人食管癌细胞ECA-109,RT-PCR检测RNF2 mRNA水平表达;MTT法检测ECA-109食管癌细胞细胞增殖;蛋白印迹法检测ECA-109-R细胞中RNF2蛋白表达变化;流式细胞技术检测照射后不同时间细胞周期和凋亡变化.Transwell侵袭小室模型检测转染对食管癌细胞迁移能力的影响.重复测量设计资料方差分析.结果 照射组食管癌细胞中RNF2 在mRNA水平和蛋白表达水平均较未照射组明显增加(P<0.01),且存在剂量-效应关系;MTT结果显示食管癌细胞的增殖水平在照射后不同时间点均明显降低(P<0.01);ECA-109-R组细胞中BMI1、RNF2蛋白表达水平较ECA-109组和ECA-109-N组细胞明显降低(P<0.01),ECA-109组与ECA-109-N组比较差异无统计学意义(P>0.05);Transwell侵袭小室模型检测结果显示照射后3.5 h ECA-109-R组穿膜细胞数明显低于ECA-109组和ECA-109-N组(P<0.01).6 Gy照射后各实验组处于G2+M期比例明显高于相应未照射组(P<0.01),且ECA-109-R组处于G2+M期的比例均明显低于照射后的ECA-109组和ECA-109-N组(P<0.05).照射后ECA-109-R组细胞凋亡率明显高于ECA-109组和ECA-109-N组(P<0.01).结论 采用RNA干扰技术降低食管癌细胞中RNF2的表达,降低细胞增殖和迁移能力,解除照射后G2+M期阻滞,促进细胞凋亡,增加放射敏感性.
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放射耐受食管鳞癌细胞系基因表达谱研究
目的 构建放射耐受食管鳞癌细胞系,筛选放射耐受相关基因及探索耐受机制.方法 利用放射线反复照射食管癌细胞系KYSE410,构建放射耐受细胞系KYSE410-res.检测照射前后食管癌细胞增殖与凋亡情况,通过基因芯片技术检测放射线处理前后食管癌细胞基因表达差异情况,并对差异明显的基因进行验证.采用成组t检验.结果 KYSE410-res细胞较KYSE410细胞抗凋亡能力和增殖能力显著提高(P值均＜0.05).基因芯片结果显示KYSE410-res细胞中表达上调≥4倍基因有463个,下调≥4倍基因有251个.差异表达基因的功能主要集中在细胞增殖、粘附、信号转导、血管生成、活性氧代谢、细胞损伤修复及MAPK/ERK信号通路,OAS2和UBD是重要节点蛋白.荧光定量PCR法检测HLA-DQB1、MMP1、NCAM1、ZNF521、GPC6、SELENBP1、LCN15、TFPI-2基因在KYSE410-res细胞中表达情况与基因芯片结果一致.结论 MAPK/ERK信号通路的异常激活、OAS2和UBD基因的表达上调、TFPI-2基因的表达下调伴随MMPs的表达上调,可能是食管癌细胞放射耐受的机制之一.
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食管癌中血管内皮生长因子的表达及其对预后的意义初探
血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤组织中重要的促血管生长因子,它参与肿瘤细胞的生长、分化、转移、增殖等过程,有关食管癌中VEGF的表达情况国内报道较少,国外报道也有争议.本研究采用多种技术方法检测了食管癌细胞系和肿瘤组织标本中VEGF的表达,结合临床资料分析了VEGF蛋白表达对食管癌放疗疗效的影响,试图为靶向基因技术与放疗结合提供一定的理论依据.
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无线粒体DNA的食管癌细胞系的建立
许多疾病的发生与线粒体功能缺陷有关,有人统称为线粒体疾病[1].为进行线粒体功能缺陷发生机制的分子遗传学研究,需要建立一个特殊的能将一个细胞的线粒体移向另一个细胞,或者引入新的基因进入线粒体的细胞模型,这就是无线粒体DNA(mitochodrial DNA, mtDNA)的人类细胞系(即ρ0细胞).本工作参照文献[2],运用国内的食管癌细胞系,建立了无mtDNA的细胞系.
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pEgr-P16重组质粒的构建及其在EC9706细胞中的辐射诱导表达
目的:构建pEgr-P16重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中的辐射诱导表达.方法:人P16cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成pEgr-P16重组质粒,利用脂质体介导转染人EC9706细胞,用Western blot方法检测不同剂量γ射线照射后被转染细胞中P16的表达.结果:酶切鉴定证实pEgr-P 16重组质粒构建正确.被pEgr-P16重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量γ射线照射后,P16基因表达均高于未照射组.结论:γ射线可诱导pEgr-P16重组质粒在人EC9706细胞中表达增强.
关键词： Egr-1启动子 γ射线 p16表达 食管癌细胞系 Western blot -
HPV18 E6 E7基因诱发的人胎儿食管上皮永生化和恶性转化细胞端粒长度和端粒酶活性
目的:探讨端粒长度、端粒酶活性以及端粒酶亚单位组分(hTERT、hTR)的表达与食管上皮细胞永生化和恶性转化之间的关系.方法:对HPV18E6E7基因诱发的人胎儿食管上皮永生化细胞系SHEE和恶性转化细胞系SHEEC,通过Southern blot检测端粒长度(TRF),TRAP法测定端粒酶活性,RT-PCR研究端粒酶催化亚单位(hTERT)和端粒酶RNA成分(hTR)的表达.结果:SHEE细胞和SHEEC细胞的端粒平均长度比正常食管上皮细胞的明显缩短,但稳定维持在一定长度范围内.SHEE细胞和SHEEC细胞均具有端粒酶活性,并均有hTERT和hTR表达.结论:端粒酶表达活化使端粒维持在一定长度是永生化食管上皮细胞SHEE和恶性转化细胞SHEEC能够稳定分裂增殖的重要因素之一.
