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社区获得性胃肠炎患者中分离出香港海鸥形菌的研究报告
目的了解中国内地社区获得性胃肠炎患者是否存在香港海鸥形菌感染.方法于2005年8月对杭州市第一人民医院肠道门诊就医患者采集粪样,分别接种SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂(MA)以及改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)等6种平皿,对分离到的可疑细菌进行常规生理生化实验、16S rRNA基因序列测定、透射电镜(TEM)下形态观察及药敏试验.结果编号为242的标本,在CMA平皿上生长出无色、透明的微小菌落.该菌为革兰阴性,氧化酶、过氧化氢酶、尿素酶和精氨酸双脱氢酶阳性,鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶阴性,不发酵葡萄糖.经16SrRNA基因序列测定,菌株242的基因序列长度为1413 bp,采用Blast软件对测序结果进行同源性分析显示,与文献报道的香港海鸥形菌同源值达100%.TEM下可见菌体两端有多根鞭毛.药敏试验结果显示,该菌对临床常用的21种抗菌药物表现出不同程度的耐药性,其中对青霉素、氨苄西林、头孢哌酮、头孢他啶表现为耐药.结论证实中国内地社区获得性胃肠炎患者粪便中存在香港海鸥形菌.有关该菌引起感染性腹泻疾病的致病地位与流行病学等特征需进一步深入研究.
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细菌基因检测在慢性前列腺炎诊断中的应用研究
目的 建立基于16SrRNA基因的PCR细菌学检测方法,用于慢性前列腺炎患者EPS的细菌学检查,以指导临床诊断和治疗.方法 建立细菌PCR检测方法,对58例慢性前列腺炎患者的EPS或VB3标本和30例健康对照标本进行检测,并作细菌培养检查.结果 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在1 500 bp处有一明显条带,经过优化的PCR方法检测细菌的敏感性为103/ml(每毫升中细菌的个数,下同).慢性前列腺炎患者的EPS标本PCR检测阳性率46.6%(27/58),培养法阳性率为6.9%(4/58),以PCR法的阳性率较高 (χ2=9.772,P＜0.05).对照组标本PCR检测阳性率为10.0%(3/30).结论 基于16SrRNA基因的PCR方法具有快速、简便、稳定、不受干扰等优点,可用于慢性前列腺炎患者EPS的细菌检测.
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用16SrRNA基因诊断自发性腹膜炎23例
1 材料和方法1.1 材料 23例肝硬变失代偿期患者,男17例,女6例,平均年龄42.6岁,全部为近期河南医科大学一附院消化科住院的患者,均有中等量或大量腹水,利尿治疗效果不佳.
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PCR方法在自发性细菌性腹膜炎快速诊断中的应用
目的 探讨PCR法在快速诊断自发性细菌性腹膜炎中的临床应用价值.方法 本研究选取64例肝硬化失代偿期伴腹水的住院患者作为研究对象,收集其血液标本及腹水标本,用基于细菌16S rRNA基因的聚合酶链反应(PCR)方法检测患病组(A组,15例)、非患病组(B组,6例)以及临床感染组(C组,43例)腹水中的细菌;并比较PCR方法与腹水培养法的灵敏度和特异度等.结果 PCR法检测A组、B组和C组患者腹水细菌的阳性率分别为100%(15/15)、0(0/6)和83.7%(36/43).PCR法诊断自发性细菌性腹膜炎的方法学指标显示,A组:灵敏度和阳性预测值分别为100%(15/15)和100%(15/15); C组:灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为97.1%(33/34)、77.8%(7/9)、94.3%(33/35)和87.5%(7/8).PCR法诊断非感染性腹水的特异度和阴性预测值分别为100%(6/6)和100%(6/6).PCR法与腹水培养鉴定细菌种属的差异无统计学意义(χ2 = 5.625,P = 0.25).结论 PCR法优于腹水培养,其阳性率、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均较高,具有早期、快速诊断自发性细菌性腹膜炎的重要的临床应用价值.
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新生儿下呼吸道多重耐药鲍氏不动杆菌感染与环境同源性追踪分析
目的 查找新生儿下呼吸道多重耐药鲍氏不动杆菌感染与环境菌株的同源性,追踪可能的传播链,为下一步干预措施的制定提供科学依据.方法 对医院2017年6月-2017年12月培养出多重耐药鲍氏不动杆菌的下呼吸道感染患儿进行环境追踪,通过16S rRNA基因测序和系统进化树进行菌株鉴定,对分离到的鲍氏不动杆菌采用Eric-PCR和MLST进行基因同源性分析.结果 共采集多重耐药鲍氏不动杆菌感染患儿环境标本207份,其中阳性标本61份,占29.47％;16S rRNA基因同源性及系统进化分析显示,15株细菌属于鲍氏不动杆菌菌种;Eric-PCR得到A-I型9个型别,综合MLST分析结果显示,2号患儿痰液标本 、输液泵 、责任护士护士服,1号温箱表面与同期采样病房的电脑键盘,及3号患儿监护仪和责任护士手为同一ST2型别.其余型别为ST195,ST208,ST191,ST75,ST92,ST235.结论 通过对新生儿下呼吸道多重耐药鲍氏不动杆菌感染患儿环境追踪发现,与环境分离菌株具有同源性,说明有效控制环境污染有助于防控感染传播扩散.
关键词： 新生儿 多重耐药鲍氏不动杆菌 16SrRNA基因 环境追踪 同源性分析 -
PCR检测细菌16s rRNA基因在临床感染性疾病诊断中的应用
目的 建立检测临床常见细菌16 s rRNA基因的PCR方法.方法 分析细菌16 s rRNA基因保守区,设计通用引物对7种常见细菌16 s rRNA基因进行PCR扩增;并用该方法检测临床血液标本中的16 s rRNA基因表达,与传统培养方法结果进行比较.结果 7种标准菌株均出现特异阳性条带;感染性疾病血液标本16 s rRNA基因阳性表达.结论 16 s rRNA基因PCR法可用于快速检测临床细菌感染.
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16SrRNA基因序列分析鉴定小分子抗菌肽产生菌株HD1.7
乳酸菌是一类发酵糖产生大量乳酸的兼性厌氧菌,广泛应用于医药、食品及发酵工业,该菌除了产生乳酸外,还可以产生一些有抑菌或杀菌作用的物质.乳酸链菌肽就是乳链球菌代谢产生的小分子抗菌肽,目前被世界上50多个国家和地区应用为食品的天然防腐剂.我们在进行L-乳酸菌应用研究过程中从酸菜发酵汁中分离到了能产生抑菌物质的菌株HD1.7,并对该菌株进行了系统的表型鉴定,初步确定为乳酸杆菌.
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16SrRNA基因在鉴别非细菌性前列腺炎中的应用价值探讨
目的 探讨16SrRNA基因在鉴别非细菌性前列腺炎中的应用价值.方法 采取PCR方法检测我院2010年1月到2011年12月间40例非细菌性前列腺炎患者(研究组)和30名正常人(对照组)前列腺液中16SrRNA基因表达情况.结果 通过两组的数据比较研究组中16SrRNA基因阳性有22例,阳性率为55.0％；对照组中16SrRNA基因阳性有3例,阳性率为7.5％,数据比较差异有统计学意义(X2 =7.35,P ＜0.05).结论 临床中检测16SrRNA基因对非细菌性前列腺炎的诊断具有重要的应用价值.
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L.sp.HXQ001菌株16SrRNA基因序列及聚类分析
目的在表型鉴定的基础上使用遗传学方法鉴定一株明串珠菌属的细菌.方法扩增L.sp.HXQ001菌株16SrRNA基因并测序,将结果与同属,非同属的乳酸菌作同源性比较.结果 losp HXQOO1菌株与同属的乳酸菌柠檬色明串珠菌的同源性为98%～99%,与肠膜明串珠菌的同源性为95%以上,与非同属的乳酸菌酒类酒球菌和类肠膜魏斯菌的同源性均小于70%.结论 L.sp.HXQ001菌为柠檬色明串珠菌.
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6种常见呼吸道感染细菌16s rRNA基因的克隆与鉴定
目的:克隆并鉴定6种常见呼吸道感染细菌16s rRNA基因,为制备基因芯片探针做准备.方法:设计、合成6种细菌16s rRNA基因扩增引物;PCR扩增16s rRNA基因目的片段;克隆16s rRNA基因片段;后对重组质粒进行鉴定.结果:(1)6种细菌16s rRNA基因片段的PCR扩增结果:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌在1 300 bp处出现特异的目的片段;铜绿假单胞菌在1 100 bp出现特异的目的片段,与预计的片段大小吻合.(2)PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化JM109受体菌之后在Ampr培养基表面生长,其中蓝色菌落为阴性克隆,白色菌落是阳性克隆.(3)各克隆质粒PCR鉴定及双酶切鉴定,结果均可见特异目的带.(4)克隆质粒的序列分析示:6种细菌克隆质粒部分16s rRNA基因序列与GenBank中发表序列同源性为99.8%以上,说明细菌16s rRNA基因已克隆成功.结论:成功克隆了大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌及铜绿假单胞菌16s rRNA基因片段,为制备基因芯片探针奠定了基础.
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慢性前列腺炎患者前列腺液细菌16S rRNA基因的检测
目的 通过采用聚合酶链反应(PCR)技术对慢性前列腺炎患者前列腺液中细菌16S rRNA基因检测,探讨PCR方法诊断慢性前列腺炎细菌学病因的价值.方法 收集102例慢性前列腺炎患者的前列腺液进行细菌培养,同时采用PCR法检测前列腺液中细菌16S rRNA基因,并测定和分析所得片段的DNA序列.对培养结果与PCR法检测结果进行了比较.结果 102份前列腺液标本中,细菌培养法18例阳性,84例阴性,阳性率17.7%;PCR法71例阳性,31例阴性,阳性率69.6%.细菌培养法与PCR法检测结果比较,其差异有统计学意义(P<0.05﹚.测序结果显示DNA序列与GenBank公布的16S rRNA基因序列具有很高的同源性.结论 PCR技术对慢性前列腺炎的临床诊断具有重要意义.
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多重PCR在幽门螺杆菌检测及分型中的应用
应用多重PCR同时扩增16 SrRNA和cagA基因来检测幽门螺杆菌感染及其分型.PCR产物经DNA序列测定证实为特异性扩增,敏感度为102 CFU/ml.48株Hp菌株中,Ⅰ型菌株(cagA+)26株(54.2%);550份胃粘液标本,Hp阳性(16 S rRNA基因+)261份(47.5%),其中Ⅰ型Hp 139份(53.3%).
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细菌、支原体通用引物PCR 扩增研究
以原核生物16SrRNA基因(16SrDNA)为靶基因，自行设计细菌和支原体通用引物，并建立PCR扩增体系。其对细菌、支原体诊断特异性强，灵敏度达一个菌体，扩增产物经DNA测序证实正确性佳。目的在于探讨细菌和支原体通用的快速基因诊断技术。
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利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌
目的:建立一种基于线性指数聚合酶链式反应(linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的方法.方法:首先根据海洋弧菌的16S rRNA基因和外膜蛋白K(OmpK)基因的目的片段设计引物并优化反应条件进行LATE-PCR扩增,其次利用酶促反应处理PCR产物中干扰焦磷酸测序反应的副产物,后加入退火引物后直接进行焦磷酸测序.结果:成功进行了LATE-PCR扩增,制备出足量单链DNA模板供焦磷酸测序反应;取1～2μL的PCR产物即可获得理想的焦磷酸测序信号.测序结果与Sanger法的结果一致,测得序列与GenBank所报道的相符合.通过对16S rRNA基因片段的检测,可以确认样品是否为海洋弧菌;通过对OmpK基因目的片段的检测可以初步区分弧菌种类,对3种常见弧菌:副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌成功地进行了检测.结论:本方法结果准确,灵敏度高,操作简便且成本低,可快速检测大量样品,在弧菌快速检测和诊断中具有很好的应用前景.
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新疆伊犁地区无形体流行病学调查及病原16SrRNA序列分析
目的 调查新疆地区人、家畜动物包括羊、牛、马及野生动物旱獭、大尾黄鼠及家养马鹿等无形体感染及病原16SrRNA序列特征.方法 采集伊犁地区正常人、牛、马、羊及野生啮齿动物大尾黄鼠、旱獭血液.微量间接免疫荧光检测方法(mIFA)检测血清无形体IgM、IgG抗体.巢氏PCR扩增无形体16SrRNA基因并分析序列特征.结果 当地人群无形体IgG抗体阳性率为5.3%;羊、牛及马为6.9%、6.3%及9.1%.PCR结果发现羊、牛及马无形体16SrRNA基因检出率为38.9%、37.5%及36.4%.16SrRNA(228bp)序列分析显示存在明显变异株,同源比较结果提示这些变异株在我国其他地区及周边国家媒介及动物宿主中均有广泛分布.结论 新疆伊犁地区存在人及家畜无形体感染.开展发热病人无形体实验室调查及进一步人群、媒介种类、宿主与无形体生态学关系研究十分必要.
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黄姑鱼创伤弧菌的分离和鉴定
目的 从患病黄姑鱼体内分离出致病力较强的菌株L1,人工感染实验证实该菌株为黄姑鱼的病原菌.对该细菌进行了形态、生理生化特性测定和16SrRNA分子鉴定,测定16SrRNA 基因序列,分析相关细菌相应序列的同源性,构建了系统进化树.结果 表明菌株L1与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的亲缘关系近,具有98.7%的同源性.结合该菌株的生理生化特性,可鉴定菌株L1为创伤弧菌.
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快速检测细菌并革兰分型的半巢式聚合酶链反应及其初步应用
目的以半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细菌及作革兰阴、阳性分型,并与细菌培养法比较.方法以细菌16S rRNA基因为靶序列,采用一对通用引物(pm1, pm3)和一条革兰阴性型特异性引物(pm2),以半巢式PCR方法扩增实验室保留菌株的DNA并作出革兰染色分型;以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV-DNA阳性血清以及白假丝酵母菌为对照,检测此方法的特异性;采用倍比稀释菌液作敏感性实验;与细菌培养法比较,验证此方法检测临床标本的敏感性. 结果对17个实验室保留菌株进行检测,以通用引物对作第1次PCR均得到371 bp长度的DNA片段;再以革兰阴性菌特异引物对(pm2, pm3)作第2次PCR,9种阴性菌均得到353bp的DNA片段,而8种阳性菌未被扩增.特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应.敏感性实验表明,采用半巢式PCR可检测出3个CFU的细菌.对120份临床标本检测,半巢式PCR检测阳性率(29.2%)显著高于细菌培养法检测阳性率(17.5%). 结论此半巢式PCR检测细菌方法,具有特异、敏感、快速的特点,并能对细菌进行革兰阴性、阳性分型,可用于临床感染性疾病的初步诊断.
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16S rRNA基因序列分析在非典型菌株鉴定中的应用
目的:建立16S rRNA基因序列分析鉴定细菌的方法,评价其对常规方法不能鉴定菌株的鉴定效果.方法:选择细菌的16S rRNA基因为靶序列,在两端保守区设计引物,对三株生化、形态不典型菌株提取模板进行PCR扩增,PCR产物纯化后进行克隆,测序.结果:三株细菌的16S rRNA基因序列与Genbank比较,YCI序列与大肠杆菌相似性＞99%,YC2序列与肺炎克雷伯菌相似性＞99%,YC3序列与缓症链球菌相似性＞98%.结论:16S rRNA基因序列分析的方法可以较好地鉴定常规方法难以鉴定的不典型菌株.
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线粒体DNA序列分析鉴定4种蛇粗毒
目的 利用PCR技术鉴定干燥蛇粗毒的来源.方法 从4种蛇粗毒中提取总DNA--其中包括1份已保存了7年的干燥眼镜蛇粗毒,并分别以从蛇粗毒和肌肉组织中提取的总DNA作为模板用1对线粒体16S rRNA基因引物进行扩增.结果 测序结果提交NCBI,并与GenBank中的同源序列进行比对.结论 序列比对和系统发育分析的结果证实,该扩增的即为正确的蛇粗毒来源物种的线粒体16S rRNA基因序列,该技术有可能推广用于对动物粗毒的来源进行准确和直接地鉴定.
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雾霾天气下佩戴防颗粒物口罩的微生物学评价研究
目的 对在雾霾天气下佩戴的日常自吸式防颗粒物口罩进行微生物学评价,并给出推荐的累计佩戴时间,提高公众健康防护水平. 方法 选取在雾霾天气下佩戴的自吸式防颗粒物口罩,记录口罩基本情况,分别对其外层及内层材料进行细菌总数、真菌总数、溶血菌总数的检测,利用16S rRNA基因鉴定纯化菌株的生物学分类,并将微生物指标与口罩累计佩戴时间进行相关性拟合. 结果 日常自吸式防颗粒物口罩内层材料上附着的微生物与口罩累计佩戴时间呈现正相关,模拟出两条拟合度较高的多项式预测曲线(R2细菌总数=0.994,R2真菌总数=0.965),而外层材料的微生物与口罩累计佩戴时间无明显相关性.在累计佩戴时间为5～7h时,口罩内层材料中细菌总数和真菌总数呈现急速增长.在口罩内、外层材料中分离纯化的菌株主要分属厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria),其中以厚壁菌门芽孢杆菌目(Bacillales)细菌多.大部分纯化菌株为环境非致病菌,仅在口罩内层材料上分离到一株金黄色葡萄球菌. 结论 随着口罩累计佩戴时间增长、累计佩戴次数增加,口罩内层材料中微生物浓度相应增加,在累计佩戴时间为5～7h时,微生物浓度急速增加,致病菌或条件致病菌检出率增高.建议健康人群在佩戴同一防护口罩时累计时间控制在7h以内,而免疫力低下人群累计佩戴时间应控制在5h以内.
