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一种用于血液制品的病毒灭活剂--辛酸盐
本文介绍一种新型病毒灭活剂--辛酸钠,可用于血液制品的病毒灭活.其优点是辛酸钠长期以来用作血液制品的稳定剂,已被证明是安全可靠的.与传统的S/D灭活剂相比,辛酸钠灭活病毒的作用时间短、效果好,故不影响蛋白质的生物活性,因此产品的回收率较高.
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血浆制品中人细小病毒B19的灭活/去除研究进展
存在于血浆制品中的人细小病毒B19(human parvovims B19,B19)是传播B19的潜在危险,尤其是B19可经污染的血浆制品的输注而在易感人群中传播.据认为,B19对普通的理化灭活方法有较强的抵抗力.然而,各项研究显示,B19对加热和低pH处理较敏感.因此,可以选择合适的方法来灭活B19.
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短波紫外线对人凝血因子Ⅷ中猪细小病毒灭活的研究
目的 研究短波紫外线(short-wave ultraviolet-C,UV-C)对人凝血因子Ⅷ(human coagulationfactor Ⅷ,FⅧ)中猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活的效果.方法 将PPV作为指示病毒与FⅧ中间品混合,用紫外灭活仪UVivatec分别以200、300和400 J/m2 UV-C进行灭活.将UV-C灭活的FⅧ接种ST细胞并进行培养,采用细胞病变(cytopathic effect,CPE)法检测病毒,并以Reed-Muench法计算病毒滴度.对所有UV-C灭活后未出现CPE的样品盲传3代,验证灭活效果;同时对UV-C灭活前后的FⅧ活性进行检测.结果 3个照射剂量的UV-C灭活后,FⅧ中的PPV滴度降低均不低于每0.1 ml4.62lg半数组织培养感染剂量,所有未出现CPE的样品盲传至第3代均未检到病毒.UV-C灭活的FⅧ的活性无明显降低,且各项质量指标均符合药典的要求.结论 UV-C可有效灭活无包膜病毒PPV,且对FⅧ活性无明显影响.
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不同保护剂对人凝血因子Ⅸ制品干热灭活的活性影响
目的 筛选用于人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor Ⅸ,FⅨ)干热灭活的保护剂.方法 分别将质量分数为1.0％、1.5％和3.0％的甘氨酸、盐酸精氨酸、甘露醇和蔗糖溶液作为保护剂加入同一批次FⅨ半成品,对含不同保护剂的FⅨ半成品进行冻干和干热灭活(100℃处理30 min),测定干热灭活前后FⅨ冻干制品的活性.结果 干热灭活后,以1.5％盐酸精氨酸作为保护剂的FⅨ冻干制品的活性高,平均55.5±1.2 IU/ml,回收率达100.2％;甘氨酸对FⅨ具有一定的保护作用,含甘氨酸保护剂的FⅨ冻干制品与不含保护剂的FⅨ冻干制品间的活性差异有统计学意义(t=0.442,P=0.002);含甘露醇(t=0.030,P=0.325)或蔗糖(t=-1.120,P=0.532)保护剂的FⅨ冻干制品与不含保护剂的FⅨ冻干制品间的活性差异均无统计学意义.结论 1.5％盐酸精氨酸是FⅨ冻干制品干热灭活的理想保护剂.
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静脉注射人免疫球蛋白工艺中的病毒灭活方法初探
目的 研究静脉注射人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)工艺中辛酸处理联合20 nm膜过滤的病毒灭活/去除方法.方法 分别将脂包膜Sindbis病毒和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)加入pH(4.6±0.1)和pH(5.3±0.1)IVIG中间品(辛酸沉淀后上清液),在(7.47±0.39)、(14.47±0.39)和(22.47±0.39) mmol/L辛酸条件下维持(25±1)℃处理120min;将非脂包膜猪细小病毒(porcine parovirus,PPV)加入pH(6.0±0.2)MG中间品(层析流穿液),用20 nm膜过滤.检测所有样品处理前后的病毒滴度.结果 (25±1)℃处理120m in后,pH(4.6±0.1)IVIG中间品分别经(7.47±0.39)和(14.47±0.39) mmol/L辛酸钠处理后的残余病毒滴度均≤0.501g,pH(5.3±0.1)IVIG中间品分别经(14.47±0.39)和(22.47±0.39) mmol/L辛酸处理后的残余病毒滴度均≤0.50lg;20 nm膜过滤可使MG中间品的PPV滴度下降≥4.00lg.2种处理方法的结果均符合相关规定的要求.结论 在一定条件下,辛酸处理联合20 nm膜过滤可有效灭活/去除MG生产过程的相关病毒.
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流行性感冒病毒裂解疫苗灭活试验探讨
目的进行流行性感冒病毒裂解疫苗的病毒灭活检测,研究病毒灭活状况.方法将单价病毒液接种鸡胚尿囊腔,第二代鸡胚尿囊液检查不应出现血凝反应.结果半成品配制前,200批单价病毒液灭活试验全部通过,单价病毒液中较高的血凝素含量会影响灭活试验的判断.结论试验表明疫苗中无活病毒存在,生产过程中血凝素含量应适当控制.
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血浆蛋白分离及病毒灭活的新进展
2000年7月9～14日在奥地利维也纳召开了国际输血学会第26次会议,会议介绍了血浆蛋白分离及病毒灭活的新进展.
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溶剂/去污剂处理法对人凝血因子Ⅷ中指示病毒灭活效果的验证研究
人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,FⅧ)等血液制品在和平/战争时期的急创伤救治及特定疾病防治中发挥重要作用,但其病毒安全性不容忽视,对血液制品进行有效的病毒灭活可明显降低因输注血液制品而传播病毒性疾病的风险,并保证血液制品的病毒安全性.为尽可能降低血液制品的病毒传播风险,国内、外颁布了相关指导原则,对制品的病毒灭活/去除作出了具体要求[1-2].溶剂/去污剂(solvent/detergent,S/D)处理法是1985年在美国获得许可用于凝血因子病毒灭活的方法[3],通过化学试剂破坏含脂质的病毒包膜而使病毒失去传染性或复制能力,目前已在多个国家推广使用.本研究利用伪狂犬病病毒(pseudorabies,PRV)、Sindbis病毒作为指示病毒,验证S/D处理法在FⅧ生产过程中的病毒灭活效果.
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运用FQ-PCR技术监测亚甲蓝光化学法对血浆丙型肝炎病毒的灭活效果
目的:通过荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对血浆病毒灭活前后丙型肝炎病毒RNA (HCV-RNA)浓度的测定,判断亚甲蓝(MB)光化学法灭活血浆丙型肝炎病毒的效果,为临床判别病毒灭活效果提供直接和客观依据.方法:4份经证实为HCV-RNA阳性的血浆分别加入MB,终浓度为1μmol/L,经可见光(大于30000Lux)照射不同时间(0、5、10、15和30min)后,分别用FQ-PCR测定这些血浆的HCV-RNA浓度,并与未用MB处理的血浆作比较,判断随照射时间不同,HCV被灭活的效果.结果:4份HCV-RNA阳性病人的血浆未经处理时其病毒核酸浓度分别为8.0×105拷贝/ml、1.7×106拷贝/ml、1.6×106拷贝/ml和3.1×105拷贝/ml,加入MB未经照射时HCV-RNA浓度即明显下降,可见光照射5min后HCV-RNA浓度分别下降为未经任何处理时浓度的18.75%、23.36%、4.66%和1.27%,随照射时间延长,病毒核酸浓度逐渐下降,照射30min后,HCV-RNA浓度均下降为零.结论:用MB加光照30min处理,可达到将血浆丙肝病毒灭活的效果;FQ-PCR可定量检测MB光化学法灭活丙肝病毒的过程.
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光照灭活病毒法对血浆成分的影响研究
目的:观察了光照灭活病毒法对血浆中诸成分的免疫活性及生物指标的影响.方法:应用ZBK-YBM-01仪器于可见光下,在室温照射30min.结果:除凝血因子PT、KPTT有一定程度的延长外,其它血浆白蛋白、葡萄糖、无机盐、免疫球蛋白、补体C3、C4及血浆pH值均未受影响.血浆经蛋白电泳分析,电泳迁移率与未照射前组相同.结论:光照灭活病毒法对大多数血浆成分的影响不明显,具有重要的临床应用价值.
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人凝血因子Ⅷ血液制品中的病毒灭活与验证
目的：研究人凝血因子Ⅷ制备过程中S/D病毒灭活法和80℃、72 h干热灭活法的病毒灭活工艺的灭活效果。方法经过S/D法及80℃、72 h干热法双重处理灭活病毒，并通过加入指示病毒（ PRV、Sindbis、HIV、EMCV、PPV）验证病毒灭活效果。结果上述工艺可有效灭活脂包膜和非脂包膜病毒。终制品中TNBP残余量小于1/10万（10 ppm）、吐温-80（Tween-80）残余量小于1/万（100 ppm），符合安全标准，人凝血因子Ⅷ的生物活性及其他各项指标未发现明显变化。结论可以作为人凝血因子Ⅷ实验过程中的病毒灭活方法。
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动物源性透明质酸钠的病毒灭活工艺
为确保动物组织来源透明质酸钠的安全性,本研究选择有效的病毒灭活工艺并进行验证.所用动物组织为鸡冠,选择小鼠脑脊髓炎病毒、水泡性口炎病毒、猴空泡病毒40和伪狂犬病毒作为相关的指示病毒.选择透明质酸钠制备工艺中的酶解工艺作为可能灭活病毒的工艺,酶解工艺对小鼠脑脊髓炎病毒、水泡性口炎病毒、猴空泡病毒40和伪狂犬病毒的平均灭活对数值分别为6.125、5.438、5.792和5.250 1gTCID50/0.1 ml.
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荧光定量PCR法评价核黄素光化学法灭活全血病毒的效果
目的 了解荧光定量PCR法(qPCR)评价核黄素光化学法灭活含疱疹病毒8型(HHV-8)全血的效果.方法 在常规检测合格的全血中,分别加入含105、106、107 copy/mL HHV-8的淋巴细胞BC-3和核黄素,以40～160 J/mLRBc的紫外光辐照进行病毒灭活.以HHV-8ORF26为中心设计4对PCR套式扩增引物(产物长度为2 998、1 252、561、206 bp),构建和优化PCR预扩增条件,以qPCR检测灭活前、后4个片段在不同辐照条件下的扩增产物经梯度稀释的Ct值,计算相应的病毒滴度ALog值,以评估对病毒核酸的损伤情况.结果 核黄素光化学法对全血中HHV-8核酸有损伤作用,PCR预扩增HV-1(2 998 bp)片段可用于评估辐照后HHV-8的病毒核酸损伤情况.病毒滴度ALog值随着病毒滴度、辐照强度和扩增片段长度的增加,高达1.9 Log值.结论 在HHV-8高流行区缺乏常规血液筛查HHV-8方法情况下,可采用核黄素光化学法进行体外灭活,降低其传播的可能性.
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利用甲型流感病毒阳性临床标本制备质控品
目的 制备一种能适用于甲型流感病毒核酸提取和PCR检测全过程的质控品.方法 采用TRIzol试剂灭活高、中、低3种浓度的甲型流感病毒阳性的痰液标本,分析TRIzol试剂对检测结果的影响;放置于35℃以及反复冻融,评估灭活后标本的稳定性;并在不同实验室间采用不同试剂进行适用性评价.结果 TRIzol试剂对核酸检测无影响,处理后的高、中、低浓度标本反复冻融40次病毒浓度无明显降低,变异系数分别为1.26％、1.54％、1.54％,均低于试剂盒批内精密度.TRIzol试剂处理的标本在35℃环境保存40 d后高、中、低浓度变异系数分别为3.13％、2.77％、2.20％,变异系数均低于试剂盒批间精密度.在不同单位采用不同试剂均能检测出高、中、低不同浓度质控品.结论 采用TRIzol试剂灭活甲型流感病毒阳性标本制备的质控品在瓶间差、热稳定和长期保存时效等方面性能较优,可成为日后临床实验室开展甲型流感病毒核酸检测的理想质控品.
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尿胰蛋白酶抑制剂生产中病毒灭活工艺的效果观察
目的 验证尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)生产工艺中采用的60 ℃水浴10 h和乙醇处理3 h的病毒灭活效果.方法 将Sindbis病毒、伪狂犬病毒(PRV)和脊髓灰质炎病毒(PV1)3种指示病毒分别加入不同的UTI原料样品中,进行60 ℃水浴10 h和乙醇处理3 h,处理不同时间后分别取样,用微量细胞病变法检测不同时间段样品中的病毒残留滴度.结果 60 ℃水浴10 h可灭活(6.503±0.102)LgTCID_(50)/mL的Sindbis病毒,灭活(6.42±0.158)LgTCID_(50)/mL的PRV以及(6.587±0.061)LgTCID_(50)/mL的PV1.乙醇处理3 h后可灭活(5.88±0.204)LgTCID_(50)/mL的Sindbis病毒,灭活(6.378±0.268) LgTCID_(50)/mL的PRV以及(5.963±0.118)LgTCID_(50)/mL的PV1.经两种方法处理后的样品加入细胞经3代盲传均未见细胞病变(CPE)出现.结论 UTI生产工艺中采用的60 ℃水浴10 h和乙醇处理3 h 均可灭活所验证的3种指示病毒,灭活效果>6.0 LgTCID_(50)/mL.
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碱处理法在人神经生长因子注射液制备中的应用
目的 进一步提高人神经生长因子 (hNGF) 注射液的安全性,寻找碱处理灭活制品中可能存在脂包膜和非脂包膜病毒的佳工艺.方法 在hNGF注射液中间品中加入脂包膜和非脂包膜病毒,通过调整其pH值、蛋白质浓度等参数后,在25℃下的不同时间,监测其灭活病毒效果.结果 在pH(12.0±0.1)、(25±1)℃条件下存放2 h,可有效灭活加入的脂包膜和非脂包膜病毒,且其他相关指标也达到要求.结论 碱处理法是同时灭活生物制品中脂包膜和非脂包膜病毒的1种经济、有效的方法.
关键词： 人神经生长因子注射液 碱处理 病毒灭活 -
核糖核酸Ⅱ制备及其病毒灭活工艺的验证
目的 从牛胰脏制备核糖核酸Ⅱ(RNAⅡ),对巴氏灭活法灭活病毒工艺进行验证.方法 以苯酚、氯仿抽提法制备,以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用巴氏灭活法(60℃,10 h)灭活RNAⅡ原液中病毒的效果,用纯度、A260/A280比值、紫外特征峰、完整性、含量变化考察灭活前后制剂变化.结果 制备了纯度和活性均较好的RNA Ⅱ,PPV滴度为7.7logTCID50/0.1 mL时灭活液中未检测出PPV,经盲传3代,亦未发现特异性细胞病变,灭活前后制剂无质的变化.结论 可以现行方法从牛胰脏制备较高纯度RNAⅡ,巴氏法能对RNAⅡ溶液作有效的病毒灭活处理.
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亚甲蓝/光照法病毒灭活血浆的制备及应用评价
目的 探讨亚甲蓝/光照法病毒灭活血浆的制备及其临床应用评价.方法 随机抽取200份病毒灭活血浆,检测灭活前后的血浆容量、总蛋白、凝血因子及亚甲蓝的残余量;选取15 756人份HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶联免疫吸附法检测阴性者的血浆,在病毒灭活前后分别进行HBV、HCV、HIV的核酸检测;临床随机抽取200例输注病毒灭活血浆的患者,观察病毒灭活血浆输注后是否出现输血不良反应.结果 经亚甲蓝/光照法进行灭活处理的血浆,血浆容量达到(227.34±5.21)g,回收率达到(96.67±2.34)％;血浆总蛋白、血浆凝血因子(Ⅷ因子和纤维蛋白原)回收率分别达到(88.69±3.32)％,(86.84±2.16)％和(84.62±1.86)％,与处理前相比,差异无统计学意义(P＞0.05);血浆经病毒灭活后亚甲蓝的残余量为(1.17±0.05)μmol/L,而过滤后残余量减少至(0.16±0.03)μmol/L,去除率达到86.32％;对15 756人份血浆进行HBV、HCV、HIV核酸检测,发现HBV阳性23例,HIV阳性1例,阳性率为1.52‰,进行病毒灭活后,HBV、HCV、HIV核酸检测均为阴性.病毒灭活血浆输注人体后无不良反应发生.结论 采用亚甲蓝/光照法进行病毒灭活的血浆,临床使用较安全;病毒灭活血浆能够有效降低经输血传播疾病的危险性,且不良反应较小.
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病毒灭活血浆中亚甲蓝残留量的质量控制
目的 探讨如何在提高病毒灭活血浆制备效率的基础上,尽可能减少血浆中的亚甲蓝残留量/率.方法 将30份200 ml新鲜血浆,平均分为3组,对照组使用旧型病毒灭活过滤器,实验1组和2组使用新型过滤器,对照组和实验1组对血浆中的亚甲蓝只进行1次滤除,实验2组对亚甲蓝进行2次滤除,留样测定每组滤过前、后的亚甲蓝含量,以及总蛋白和Ⅷ因子的回收率.结果 实验1组、2组与对照组的亚甲蓝释放量的差异均无统计学意义(P>0.05).实验2组与对照组的亚甲蓝残留量/率的差异无统计学意义(P>0.05),实验1组与对照组,以及实验1和实验2组的亚甲蓝残留量/率的差异有统计学意义(P<0.01),三组的总蛋白和Ⅷ因子回收率的差异无统计学意义(P>0.05).结论 对亚甲蓝进行2次滤除可大大降低血浆中的亚甲蓝残留量/率,该方法简单、高效,能够在血站推广应用.
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亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活前后血浆成分的变化
目的 探讨亚甲蓝光化学法(methylene blue photochemistry, MB-P)病毒灭活前后血浆有效成分及残留白细胞含量的变化,为临床应用病毒灭活血浆进行治疗提供剂量使用依据.方法 对152份全血分离制备的血浆进行MB-P病毒灭活,灭活前后留样,制成新鲜冰冻血浆后融化,测定纤维蛋白原、Ⅷ因子、总蛋白及残留白细胞的含量,同时计算有效成分回收率.结果 经MB-P病毒灭活后新鲜冰冻血浆中Ⅷ因子和纤维蛋白原含量明显降低,差异有统计学意义;但总蛋白含量无明显变化,Ⅷ因子回收率达到80.8%,纤维蛋白原回收率为74.9%;残留白细胞计数由(3.0±2.1)×106/L下降到(7.4±1.4)×104/L(n=30),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MB-P病毒灭活血浆可以提高血浆输注安全性.建议临床应用MB-P病毒灭活血浆应在原使用剂量基础上增加25%的用量,以保证临床治疗效果.
