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病毒灭活血浆中MB残留量检测
目的 检测病毒灭活处理血浆中亚甲蓝(methylene blue,MB)残留量.方法 将4家采供血机构(A、B、C、D)提供的血浆样品经2个不同型号的一次性病毒灭活装置处理后,采用固相萃取方法分别提取病毒灭活血浆及标准品中MB,利用高效液相色谱法检测MB含量.结果 4家采供血机构病毒灭活血浆MB平均残留量分别为(0.29±0.11)、(0.26±0.09)、(0.09±0.03)和(0.10±0.02) μmol/L.两种不同型号滤器对MB的滤除率分别为91％和73％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 目前我国病毒灭活血浆中MB残留量基本符合质量要求,但不同的采供血机构及不同滤器处理的血浆样品间MB残留量仍存在明显差异.
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一种离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ方法的建立及保护剂配方的筛选
目的 建立一种离子交换层析结合病毒灭活方式获得人凝血因子Ⅷ(FⅧ)的方法,并筛选其保护剂配方.方法 采用聚乙二醇沉淀法及离子交换层析法对血浆来源的冷沉淀进行纯化,经S/D和80℃72 h干热两步病毒灭活法进行病毒灭活,验证灭活效果,并筛选佳保护剂配方.结果 聚乙二醇沉淀后的FⅧ纯度较新鲜血浆提高了约110倍,离子交换层析纯化后FⅧ纯度提高30倍以上;S/D和80℃72 h干热法的灭活效果良好.佳保护剂配方为0.01 mol/L枸橼酸钠、0.001 mol/L氯化钙、8 mg/ml白蛋白和40 mg/ml盐酸精氨酸.结论 该方法可制备纯度较高、稳定性和安全性较好的FⅧ制品,确定的保护剂配方对干热灭活的耐受性良好.
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NaOH乙醇溶液和γ射线辐照两步法灭活壳聚糖中病毒工艺的建立
目的 建立NaOH乙醇溶液和γ射线辐照两步法灭活壳聚糖中病毒的工艺.方法 以牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)为指示病毒,分别采用NaOH乙醇溶液和γ射线辐照法灭活壳聚糖中的BVDV和PPV,并对两种方法进行优化.以优化的灭活条件建立两步法灭活工艺,测定病毒滴度、壳聚糖相对分子质量、脱乙酰度和乙醇含量.结果 含8 mol/L NaOH的10％乙醇溶液,35℃处理1h后冻干,再采用γ射线辐照(5 kGy),BVDV和PPV的滴度均下降4 lgTCID50以上,同时,壳聚糖的相对分子质量仅降低8.4％,脱乙酰度无显著变化,未检出残留乙醇.结论 NaOH乙醇溶液和γ射线辐照两步法可有效灭活壳聚糖中的指示病毒,同时对壳聚糖质量影响较小,为保证壳聚糖作为生物材料及药用辅料使用的安全性提供了保障.
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低pH胃蛋白酶-甲苯消化法灭活破伤风免疫血浆中脂包膜病毒效果验证
目的 验证低pH条件下胃蛋白酶-甲苯消化法对不同核酸类型的脂包膜病毒的灭活效果.方法 以水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)作为RNA指示病毒,以伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)作为DNA指示病毒,将破伤风免疫血浆样品经低pH(3.2±0.2)、0.2％甲苯、6～ 12活力单位胃蛋白酶处理后各取27 ml,分别加入3 ml指示病毒(9:1),在(30.0±1)℃水浴中分别振摇10、30、60、90 min灭活病毒.以Vero细胞、PK-15细胞为基质,采用96孔细胞病变法检测残余病毒滴度,验证病毒灭活效果.结果 破伤风免疫血浆样品经低pH胃蛋白酶及甲苯消化处理90 min后,VSV和PRV两种指示病毒的灭活效果分别为3.12～3.88和5.25～5.38 logTCID50/0.1 ml.结论 采用低pH胃蛋白酶-甲苯消化法对破伤风免疫血浆中PRV灭活效果较好,而对VSV灭活效果有待提高.
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静注人免疫球蛋白新生产工艺病毒灭活/去除效果的验证及评估
目的 对静注人免疫球蛋白(intravenous human immunoglobulin,IVIG)新生产工艺的病毒灭活/去除效果进行验证及评估.方法 选择4种脂包膜病毒[人免疫缺陷综合征病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SV)和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)]及非脂包膜病毒[猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)]作为验证病毒,在缩小的生产规模条件下考察辛酸钠沉淀/深层过滤、低pH孵放和纳米膜过滤步骤对一种或几种指示病毒的灭活/去除能力.结果 辛酸钠沉淀/深层过滤步骤可灭活/去除PPV 1.88 Log;低pH孵放对HIV、PRV、SV和VSV的灭活效果低分别为≥5.22、≥4.26、≥6.56和≥5.69 Log;Bio EX纳米膜可去除PPV达4 Log以上.结论 IVIG新生产工艺的病毒灭活/去除效果合格,可有效灭活/去除未知的、新出现的病原体.
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鼠神经生长因子病毒灭活效果的验证
目的 对鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor,mNGF)病毒灭活工艺进行验证.方法 以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)和Sindbis病毒为指示病毒,考察辛酸钠法对mNGF原液中病毒的灭活效果,并比较灭活后与未灭活原液的mNGF活性、纯度、等电点及其-20℃贮存0、3、6个月的稳定性.结果 mNGF原液经0.3％辛酸钠、pH(5.0-0.2)、(25±1)℃灭活90 min,PRV和Sindbis病毒滴度均下降6 lgCCID50/ml以上,灭活60、90 min样品盲传3代后,均未检测出病毒.灭活后与未灭活原液的mNGF活性无差异,比活性均在5.0×105 AU/mg以上,蛋白纯度均为100％,等电聚焦主区带均在8.65～9.30之间;-20℃贮存0、3、6个月,蛋白纯度均为100％,比活性均无明显差异,且6个月内比活性均未明显降低.结论 辛酸钠法可安全、快速、高效地灭活mNGF原液中的指示病毒及其所代表的相关病毒,保证了产品的质量及其工艺的稳定性,保障了临床用药的安全性.
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重组人IL-12病毒去除/灭活工艺的建立及验证
目的 建立重组人白细胞介素-12 (recombinant human IL-12,rhIL-12)的病毒去除/灭活工艺,并进行验证.方法 采用预过滤器(Viresolve Shield,纳米滤膜3.1 cm2)和除细小病毒过滤器(Viresolve Pro,纳米滤膜3.1 cm2)串联过滤,样品体积为90 ml,过滤时间为2h,安全系数为1.88,压力为30 psi,建立rhIL-12病毒去除工艺,分析该工艺对产品的比活性及回收率的影响,并以猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)作为指示病毒,对该工艺进行病毒去除效果验证;采用低pH孵放法(用1 mol/L HC1调pH值至3.8±0.1,室温放置180 min后,用1 mol/L NaOH调pH值至7.4)建立rhIL-12病毒灭活工艺,分析该工艺对产品的蛋白含量及比活性的影响,并分别以水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)作为指示病毒,对该工艺进行病毒灭活效果验证.结果 纳米膜串联过滤病毒去除工艺中,蛋白回收率为95.14％,比活性为过滤前的95.12％,对rhIL-12活性基本无影响;当滤出液达90 ml时,PPV下降滴度均大于4 log10,符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求.低pH孵放法病毒灭活工艺中,rhIL-12的蛋白含量在病毒灭活前后分别为359和338μg/ml,生物学活性分别为3.392×106和3.356×106 IU,均无明显变化;室温处理180 min后,指示病毒PRV、VSV的下降滴度均＞4 log10,符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求.结论 建立的rhIL-12膜过滤病毒去除工艺和低pH孵放法病毒灭活工艺均可有效地去除/灭活病毒,保证了产品的质量及安全性.
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美兰光化学法对红细胞膜的影响
目的观察美兰光化学法灭活红细胞制品中病毒对红细胞膜的影响.方法在离体条件下,观察光化学处理后单线态分子氧对红细胞膜结构及组分的影响.结果经光照灭活病毒后,红细胞膜脂质流动性,膜蛋白组分及含量与对照红细胞相比差异无显著意义,而膜脂过氧化酶含量与对照红细胞相比差异有显著意义.结论光化学处理对人红细胞膜具有一定的损伤.
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验证低pH法灭活人白细胞干扰素α病毒的效果
目的以HIV-1、VSV和Sindbis为模型病毒,验证低pH法(pH2.0)灭活人白细胞干扰素α病毒效果.方法将模型病毒按1:9(V/V)加入干扰素中,混匀后调pH至2.0.4℃放7 d后,测病毒滴度.未发现细胞病变(CPE)的样品须盲传3代并观察7 d,若仍无CPE,则判定无病毒存在.结果4 log的HIV-1、6.63 log的VSV和6.38 log的Sindbis病毒被灭活,干扰素活性未受影响.结论低pH法(pH2.0)灭活病毒经济有效,可提高人白细胞干扰素的安全性.
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人凝血酶原复合物短波紫外灭活细小病毒验证及对产品质量的影响
目的 应用短波UVC对人凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrate,PCC)进行灭活处理,验证病毒灭活效果及对产品质量的影响.方法 以猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)作为指示病毒,采用短波UVC对PCC样品进行灭活,紫外辐射剂量分别为200、250和300 J/m2,微量细胞培养法检测病毒滴度,对未出现病变的样品盲传3代,验证灭活效果;应用二维电泳(2-DE)、高效液相色谱技术(HPLC)及活性检测方法对PCC样品的结构和功能及活性进行评价.结果 短波UVC法可使PPV滴度降低4.0log以上,所有样品在肓传第3代时均检测到细胞病变.在无保护剂的情况下,凝血因子活性回收率大于70%;HPLC分析结果证实,UVC照射后,凝血因子蛋白聚合体含量无明显改变,与照射前比较,蛋白的色谱行为基本一致;2-DE检测显示,样品照射前后,图谱蛋白斑点数量基本相等,其中300 J/m2UVC处理组有2个蛋白点群出现位置和灰度值的变化.结论 短波UVC对无胞膜病毒灭活效果较好,且该灭活方法对PCC制品蛋白活性影响较小.
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巴氏消毒法对乙型肝炎人免疫球蛋白病毒灭活效果的验证
目的 以伪狂犬病病毒(PRV)、Sindbis病毒和HIV-1为模型病毒,验证巴氏消毒法对乙型肝炎人免疫球蛋白(HBIG)的病毒灭活效果.方法 将模型病毒按1:9(v/v)的比例加入HBIG样品中,60℃水浴保温10 h,测定病毒滴度,观察病毒灭活效果,并以放射免疫法测定病毒灭活前后样品抗HBsAg效价的变化.结果 病毒灭活后,PRV滴度下降超过5 LgCCID_(50)/0.1 ml,Sindbis病毒滴度下降超过6 LgPFU/mi,HIV-1滴度下降超过4 LgCCID_(50)/0.1 ml;3批HBIG样品的抗HBsAg效价分别降低了6.5%、6.0%和5.8%.结论 巴氏消毒法可以对HBIG样品中的模型病毒进行有效灭活.
关键词： 巴氏消毒法 病毒灭活 乙型肝炎人免疫球蛋白 -
水貂肠炎细小病毒及犬瘟热病毒灭活后的联合免疫效果
目的 探讨水貂肠炎细小病毒(mink enteritis virus,MEV)和犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)灭活后的联合免疫效果.方法 用甲醛灭活MEV-L和CDV-L弱毒株,固定MEV-L的血凝效价为26,与CDV-L病毒液(CDV-L TCID50 10-529/mL)分别按1∶1(Ⅰ组)、1∶2(Ⅱ组)、1∶3(Ⅲ组)的量混合,加入10％氢氧化铝胶,充分混匀后免疫大鼠,均为1 mL/只.分别于免疫前及免疫后第7、14、30、60、90天采血,分离血清,采用血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验和间接ELISA检测血清MEV抗体效价,血清中和试验和间接ELISA检测血清CDV抗体效价.结果 大鼠在免疫后7d时产生MEV和CDV抗体,30 d时抗体效价高,随后下降,90 d时抗体效价仍较高;Ⅰ组CDV抗体效价较其他两组高.结论 3组不同比例的CDV和MEV联合免疫大鼠均可产生较高的抗体水平,其中以1∶1比例的免疫效果佳.
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β-丙内酯对甲型肝炎病毒的灭活效应
目的:观察β-丙内酯对甲型肝炎病毒(HAV)的灭活效应.方法:采用1∶4000的β-丙内酯和甲醛,分别对HAV进行灭活试验.通过病毒滴度检测及病毒灭活效果验证,确定佳灭活时间；检测两种灭活剂对HAV抗原滴度和免疫原性的影响以及对小鼠和豚鼠的毒性反应.结果:β-丙内酯灭活10 h及甲醛灭活3d后,检测不出病毒；β-丙内酯作用24 h可将病毒完全灭活,比甲醛灭活12d效果更好；两种灭活剂灭活不同时间的HAV抗原滴度保持不变,均为1∶640EU/0.1ml；免疫小鼠28 d后,抗-HAV均呈阳性,阳转率达到100％,且对小鼠及豚鼠均无毒性.结论:β-丙内酯直接作用于病毒核酸基因,使HAV失去活性而保持其免疫原性.
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肌氨肽苷注射液病毒去除/灭活工艺的验证
目的 验证肌氨肽苷注射液生产工艺对病毒的去除/灭活能力.方法 以鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)作为指示病毒,采用超滤、高温灭菌法去除/灭活病毒,用SPF鸡胚和鸡成纤维细胞进行病毒去除/灭活效果验证,并进行质量检测.结果 超滤和高温灭菌后,指示病毒均未检出,盲传复壮无隐性感染,各样品的质量检测结果 均符合肌氨肽苷注射液国家药品标准规定.结论 在肌氨肽苷注射液生产工艺中,采用超滤和高温灭菌联合法去除/灭活病毒有效.
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血液制品病毒灭活罐的改进
由于生物制品生产工艺的特殊性,稀释罐、培养罐、消化罐等罐体在生物制品的生产设备中,占据着十分重要的地位.随着科技的进步,罐体正向高集成、全自动方向发展,但昂贵的造价却制约了国内企业对原有设备的更新.在资金有限的前提下,长春生物制品研究所的科技人员通过实践,对白蛋白病毒灭活用大罐的温度控制系统进行了较大的改进,使国产大罐继续发挥作用,取得了良好的经济效益.
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应采用细胞培养法取代动物试验法检定狂犬病疫苗
在<中国生物制品规程>2000年版中,规定的狂犬病疫苗的多项检定均采用小鼠实验,如病毒滴定、病毒灭活确证试验以及疫苗效力测定等.
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病毒灭活血浆制备冷沉淀凝血因子的质量分析
目的：探讨以病毒灭活血浆制备的冷沉淀凝血因子的质量，对其在临床中应用的可行性进行分析。方法选取2014年5月～2015年3月常规采集的新鲜血液130袋为材料，经离心后分离血浆，通过随机数字表法分为观察组与对照组，每组65袋，观察组制备为病毒灭活血浆，对照组制备为新鲜冰冻血浆，提取两组血浆冷沉淀凝血因子，对有效成分进行检测。结果两组血浆Fg水平、ALB水平、TP水平、PT及TT差异均无统计学意义（ P＞0．05）；观察组血浆FⅡ、FⅤ、FⅦ水平同对照组比较明显较低，差异有统计学意义（ P＜0．05）；观察组血浆APTT同对照组比较，显著较长，差异有统计学意义（ P＜0．05）；观察组血浆G水平同对照组比较，明显较低，差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论经病毒灭活的血浆制备冷沉淀凝血因子会对有效成分产生损伤，但其质量仍符合国家标准，因此病毒灭活血浆制备冷沉淀凝血因子具有可行性。
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恒温水浴工艺步骤灭活小牛血去蛋白提取物病毒效果的验证研究
目的:验证小牛血去蛋白提取物中间品生产工艺中60℃水浴7小时对产品所携带病毒的灭活效果,确定小牛血去蛋白提取物生产中病毒灭活措施的有效性.方法:选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),以及不同核酸类型的非脂包膜病毒,其中RNA病毒为呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3),DNA病毒为猪细小病毒(PPV).将四种指示病毒分别用于验证我公司经恒温水浴工艺步骤生产的小牛血去蛋白提取物中携带病毒灭活的效果.结果:感染四种指示病毒的小牛血去蛋白提取物中间品,按照生产工艺进行60℃水浴7小时处理,指示病毒灭活量均大于4logs.结论:60℃、7小时的恒温水浴工艺步骤为小牛血去蛋白提取物生产过程中的有效灭活病毒方法.
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亚甲蓝光化学病毒灭活血浆的质量控制与主要质量指标观察
目的 主要是探讨亚甲蓝(MB)光化学病毒灭活血浆在制备全过程中质量控制及病毒灭活后血浆的主要质量指标影响情况.方法 对全过程质量控制的关键点进行测量分析,对产品质量的检测是随机抽取新鲜血浆60份,于病毒灭活前后各留取血浆标本2 ml左右,对血浆中不稳定凝血因子(Ⅴ、Ⅷ)及血浆总蛋白的含量进行测定.结果 亚甲蓝光照病毒灭活后新鲜冰冻血浆中主要凝血因子及血浆总蛋白浓度含量测定分别为FⅧ:(1.32±0.45) IU/ml,FⅤ:(1.03±0.36) IU/ml,血浆总蛋白(67.81±6.22) g/L;回收率均大于80%.结论 经过全过程质量控制及产品质量检测,新鲜血浆经病毒灭活后主要凝血因子及血浆蛋白浓度含量虽均有不同程度的影响,但各项指标与病毒灭活前对比无显著差异,并符合国家<全血及成分血质量要求>,临床输注病毒灭活血浆效果良好,无输血不良反应的发生.
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利用鸭乙型肝炎病毒感染模型评价血液成分中病毒的灭活效果
目的利用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染动物模型,评价亚甲蓝光化学病毒灭活方法对血液成分中DNA病毒的灭活效果.方法将超离纯化的DHBV分别加入人血浆或人红细胞,经亚甲蓝光化学灭活病毒,将含不同基因组拷贝数DHBV的血浆成分经静脉感染1 d龄雏鸭.采用放射性核素核酸杂交法对血清中DHBV DNA进行检测,计算病毒灭活处理前、后人血浆及人红细胞中DHBV的半数感染计量(ID50).结果结果显示加入DHBV的血浆在未经灭活处理前对1 d龄雏鸭的ID50值为103.33,而经病毒灭活处理后ID50值为1010拷贝,灭活处理可使病毒感染性滴度下降达6个Log;加入DHBV的红细胞灭活前ID50值为103.35,经灭活处理后ID50值为108.35拷贝,灭活处理使病毒感染性滴度下降5个Log.结论利用DHBV感染动物模型,可以检测到少量病毒在自然感染宿主体内的感染性,可用于评判血液成分中病毒灭活方法的效果,亚甲蓝光化学处理对血浆中DNA病毒的灭活效果较好于对红细胞中DNA病毒的灭活作用.
关键词： 鸭乙型肝炎病毒感染动物模型 病毒灭活
