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编码人疱疹病毒8型小衣壳蛋白开放阅读框65的原核表达及应用
目的 构建人疱疹病毒8型(HHV8)小衣壳蛋白ORF65编码基因的原核表达载体,并进行原核表达.方法 提取BCBL-1细胞(HHV8阳性而EBV阴性)DNA,PCR技术扩增HHV8ORF65基因,目的 基因与原核表达载体pThioHis A连接后,转化宿主菌Escherichia coli BL21,异丙基硫代-D-乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,经带有6个组氨酸标签的亲和层析柱纯化获得重组抗原.重组蛋白电泳后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,与HHV8阳性血清进行免疫印迹反应.对相关患者进行检测,并与美国Biotrin公司生产的HHV8 IgM和HHV8 IgG抗体间接荧光抗体试验(IFA)检测试剂盒和德国Qiagen公司ELISA检测试剂盒进行比较.结果 DNA序列分析表明目的 基因序列与HHV8标准毒株相应序列完全一致,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳可观察到相对分子质量为31 500的融合蛋白的表达,免疫印迹反应显示重组抗原具有较高的特异性.基因工程抗原的各项技术指标与Biotrin公司和Qiagen公司检测试剂盒有较好的符合率,对临床标本的检测表明该试剂盒简单、实用、结果稳定可靠.结论 HHV8重组抗原具有较好的抗原性,进一步完善后可用于HHV8抗体的检测.
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新疆经典型卡波氏肉瘤患者不同样本HHV-8DNA病毒载量与临床分期关系初步分析
目的:了解新疆经典型卡波氏肉瘤(Kapos's sarcoma,KS)患者皮损、外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)、唾液和尿液中人疱疹病毒型(HHV8) DNA病毒载量水平及分布情况,探讨HHV8病毒载量与经典型KS临床分期之间的相关性.方法:选取2011-03-09-2012-11-11就诊于新疆医科大学第一附属医院皮肤科8例经典型KS患者的4种类型32份样本中扩增HHV8 DNA ORF26基因片段,应用RT-qPCR测定32份样本中HHV8病毒载量,评价载量负荷与经典型KS疾病临床分期之间的关系.结果:全部资料均获完整基因组DNA.新疆经典型KS患者不同样本中HHV8 DNA检出率为100％.标准曲线良好,扩增产物特异,其中,HHV8病毒载量负荷皮损组织为205.75±124.02,唾液为70.75±53.01,PBMC为39.88±26.98,尿液为28.25±12.26,差异有统计学意义,F=11.206,P＜0.001.HHV8病毒载量水平皮损组织＞唾液＞PBMC＞尿液.结论:新疆经典型KS患者多样本中均有HHV8DNA检出,HHV8病毒载量水平在皮损中高,在尿液中低,与新疆经典型KS临床分期之间未呈现相关性趋势.
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新疆经典型卡波氏肉瘤组织HHV-8与血清巨噬细胞炎症蛋白表达关系的分析
目的:初步探讨在新疆经典型卡波肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)组织人疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)阳性的患者血清中,巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory proteins-1α,MIP-1α)和MIP-1β表达水平差异与KS发病的关系.方法:采用PCR法扩增16例经典型KS肉瘤组织中HHV8ORF26基因片段,证实存在HHV-8病毒.采用ELISA法检测16例KS患者和20名健康对照者血清中MIP-1α和MIP-1β浓度水平.采用2组均数比较t检验来评价其与KS发病的相关性.结果:16例经典型KS患者HHV-8 DNA检出率为100％.MIP-1α在KS患者血清中呈现低浓度表达,为(126.72±70.26) ρg/mL；在健康对照组中均呈现高浓度表达,为(1 382.50±448.89) ρg/mL;差异有统计学意义,t=-11.05,P＜0.01.MIP-1β在KS血清和健康对照组中呈现高浓度表达,分别为(733.75士276.02)和(886.00±395.65) ρg/mL,差异无统计学意义,t=-1.304,P=0.201.结论:新疆经典型KS患者皮损组织中普遍存在HHV-8 DNA病毒,患者血清中MIPs水平的紊乱与新疆经典型KS的发病存在一定的关系.
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新疆Kaposi肉瘤患者感染的人类疱疹病毒8型ORF75基因多态性研究
目的 通过对人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF75基因多态性研究,初步探讨其与新疆Kaposi肉瘤的相关性.方法 对25例新疆Kaposi肉瘤患者石蜡包埋组织进行HHV-8 DNA抽提、扩增及双向测序,使用CLUSTALW软件和PHYLIP软件包对ORF75基因进行核苷酸多态性分析.结果 ①25例新疆Kaposi肉瘤患者有21例HHV-8感染阳性,阳性率为84%,其中7例艾滋病相关型Kaposi肉瘤(AIDS-KS)患者HHV-8感染均为阳性.②新疆Kaposi肉瘤患者HHV-8 ORF75基因核苷酸具有多态性,存在462、618、647三个主要突变位点.结论 人类疱疹病毒8型ORF75基因多态性与新疆Kaposi肉瘤具有相关性.
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17例新疆经典型卡波西肉瘤患者血清细胞因子水平和病毒感染相关性分析
目的 分析细胞因子水平、免疫状态以及人疱疹病毒8型(HHV-8)和非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)感染与新疆卡波西肉瘤(KS)发病的关系.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清细胞因子水平,HHV-8检测采用套式聚合酶链反应.结果 KS患者白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、新喋呤(neopterin)和β2-微球蛋白(β2-MG)水平均高于对照组.HHV-8感染率在KS组和对照组分别为82.40%(14/17)和20.59%(14/68),两者的差异有显著的统计学意义(x2=72.15,P＜0.001).结论 IL-6、TNF-α、VEGF等细胞因子的血清水平异常可能与KS的发生或维持KS的症状相关;新喋呤和β2-MG水平的增高反映KS患者存在免疫激活状态;证实了HHV-8与KS发病的关系.
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HHV-8与非Kaposi肉瘤组织相关性的初步研究
目的:检测人类疱疹病毒8型(HHV-8)在四种非Kaposi肉瘤皮损组织中的感染情况,以初步探讨HHV-8与皮肤鳞状细胞癌、蕈样肉芽肿、Castleman病和化脓性肉芽肿相关性研究.方法:使用酚-氯仿-异戊醇方法对新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科、病理科从2004年到2009年收集的30例鳞状细胞癌、20例Castleman病(其中5例为多中性Castleman病)、13例蕈样肉芽肿、20例化脓性肉芽肿石蜡包埋组织进行HHV-8DNA抽提;然后使用巢式PCR方法对抽提的DNA进行ORF26基因片段的扩增,扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,并在凝胶成像系统下观察电泳结果,从而确定ORF26基因阳性标本:然后计算HHV-8在各种标本中的阳性率.结果:30例皮肤鳞状细胞癌皮损组织有5份为阳性(16.7%).13例蕈样肉芽肿石蜡组织有1例为阳性(7.7%),20例化脓性肉芽肿和20例Castleman病石蜡组织中均未检出HHV-8.结论:①HHV-8可能是新疆皮肤鳞状细胞癌发病原因之一.②HHV-8与蕈样肉芽肿的发病可能不具有相关性,HHV-8可能是MF发生后偶发的一种附带感染.(③Castleman 病和化脓性肉芽肿的发病可能均与HHV-8无关.
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荧光定量PCR法评价核黄素光化学法灭活全血病毒的效果
目的 了解荧光定量PCR法(qPCR)评价核黄素光化学法灭活含疱疹病毒8型(HHV-8)全血的效果.方法 在常规检测合格的全血中,分别加入含105、106、107 copy/mL HHV-8的淋巴细胞BC-3和核黄素,以40～160 J/mLRBc的紫外光辐照进行病毒灭活.以HHV-8ORF26为中心设计4对PCR套式扩增引物(产物长度为2 998、1 252、561、206 bp),构建和优化PCR预扩增条件,以qPCR检测灭活前、后4个片段在不同辐照条件下的扩增产物经梯度稀释的Ct值,计算相应的病毒滴度ALog值,以评估对病毒核酸的损伤情况.结果 核黄素光化学法对全血中HHV-8核酸有损伤作用,PCR预扩增HV-1(2 998 bp)片段可用于评估辐照后HHV-8的病毒核酸损伤情况.病毒滴度ALog值随着病毒滴度、辐照强度和扩增片段长度的增加,高达1.9 Log值.结论 在HHV-8高流行区缺乏常规血液筛查HHV-8方法情况下,可采用核黄素光化学法进行体外灭活,降低其传播的可能性.
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人疱疹病毒8型-Kaposi肉瘤相关疱疹病毒及其相关疾病的研究进展
Kapsoi肉瘤相关疱疹病毒,又称人疱疹病毒8型,是近来发现的一种新的肿瘤病毒,它参与了Kaposi肉瘤的发病机制,并与某些血液疾病,如原发性渗出性淋巴瘤及多中心Castleman病等有关.此病毒的一系列病毒基因能干扰细胞的生长和分化,但确切的致瘤因素仍在研究中.
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含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建
目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体.方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和Xhol位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12.结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制.结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础.
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人疱疹病毒8型K12基因在大肠杆菌中的克隆和表达
目的:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因在大肠杆菌中进行融合表达.方法:设计一对PCR引物,在引物的5′端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点,用此引物从质粒pCR-K12中扩增出HHV-8的K12基因,PCR产物经双酶切后按正确阅读框连接到原核表达载体pGEX-6p-1上相应酶切位点,并转化BL21感受态细胞.结果:重组菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,菌体SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示有一个大小为33ku的融合表达蛋白产生.结论:初步表明K12基因在大肠杆菌中获得正确表达.
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Kaposi肉瘤组织内人疱疹病毒8型的K14.1基因型研究
目的:确定人疱疹病毒8 型K14.1基因等位基因型在Kaposi肉瘤中的分布,及与Kaposi肉瘤临床分型的关系.方法:使用酚-氯仿-异戊醇法对32例Kaposi肉瘤石蜡包埋组织进行病毒DNA提取,使用PCR法扩增K14.1基因片段,然后确定其等位基因型.结果:32 例中有27 例人疱疹病毒8型感染为阳性,阳性率为84.38%,其中5例艾滋病相关型KS患者HHV-8感染均为阳性,感染率100% ;在分析的27 例HHV-8病毒株中,24例为P等位基因型(包括5例艾滋病相关型KS患者皮损),3例为M等位基因型(均来自经典型KS).结论:本研究中,Kaposi肉瘤感染的人疱疹病毒8型的K14.1等位基因型以P等位基因型为主.
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人疱疹病毒8型分子流行病学研究进展
人疱疹病毒8型(HHV-8)的发现在HHV-8及相关疾病的分子生物学的研究方面开辟了一个新领域,然而,HHV-8的流行病学、实验室诊断及致病机制方面都存在着争议,本文就HHV-8的分子流行病学研究进展作一综述.
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济南地区献血者中人疱疹病毒8型(HHV-8)IgG抗体的检测及相关危险因素分析
目的:了解人疱疹病毒8型(HHV-8)在济南地区不同献血者中的感染情况,并对其与年龄、性别、HBV、HCV、梅毒螺旋体的相关性进行统计学分析.方法:以HHV-8 ORF K8.1合成多肽为抗原,采用ELISA方法检测献血者血清中相应IgG水平.结果:520份血清中抗HHV-8 ORFK8.1抗体的总体检出率为5.962%(31/520),有随年龄增加而增高的趋势,但与性别、HBV、HCV、梅毒螺旋体的相关性无统计学意义.结论:济南地区献血者中有一定比率的HHV-8感染.采取措施,防止HHV-8经输血传播具有一定的现实意义.
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人疱疹病毒8型感染的间接ELISA检测方法的建立
目的 建立人疱疹病毒8型(HHV-8)感染的间接ELISA检测方法,并初步探讨其应用价值.方法 利用PER技术获得HHV-8 ORb73C基因,插入到原核表达栽体pGEX-6P-1中,在大肠埃希菌B121(DE3)中诱导蛋白表达;以纯化的GST-ORF73C融合蛋白为包被抗原.利用方阵滴定法确定包被抗原和抗血清的适工作浓度,并通过阻断试验、交叉试验、特异性试验、重复性试验及与Chon等建立的K8.1合成多肽.ELISA检测方法进行试验比较等评价其效果.结果 SDS-PAGE及Western-blot检测结果显示,目的 基因在大肠杆菌B121(DE3)中得到高效表达,且表达产物能被KS阳性血清[HIV(+)/KS(+)血清]特异性识别;方阵滴定试验显示:包被抗原的佳浓度为1.5 μg/mL,血清抗体的佳稀释度为l:80;阻断试验、交叉试验、特异性试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性好;对86份HIV(+)/KS(-)血清样品进行检测的结果显示,该方法与Chon等建立的K8.1合成多肽.EHSA检测方法的符合率为98.8%.结论 GST-ORF73C-ELISA检测方法具有良好的特异性和重复性,可用于HHV-8感染的血清学检测及流行病学调查.
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洛阳地区无偿献血人群中疱疹病毒8型的检测
目的 了解洛阳地区无偿献血人群中疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)的感染情况.方法 采用荧光定量PCR法检测外周血单核细胞中HHV-8 DNA,同时采用ELISA方法检测血清中HHV-8抗体.结果 480份无偿献血者标本血清中HHV-8 DNA检出率为6.7％ (32/480),HHV-8抗体检出率为6.5％(31/480)；HHV-8 DNA和HHV-8抗体的检出率有随年龄增加而增高的趋势.结论 洛阳地区无偿献血人群中存在有一定比例的HHV-8感染者,建议对无偿献血者增加HHV-8感染筛查.
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新疆Kaposi肉瘤与皮肤鳞状细胞癌感染HHV-8阳性率的比较研究
目的 探讨Kaposi肉瘤与皮肤鳞状细胞癌(SCC)感染人类疱疹病毒8型(HHV-8)的差异.方法 用巢式PCR分别扩增30例鳞状细胞癌和30例Kaposi肉瘤组织皮损中的HHV-8 DNA.结果 30例皮肤鳞状细胞癌皮损组织有5份为阳性(16.7%),30例Kaposi肉瘤组织有28份为阳性(93.3%).结论 鳞状细胞癌感染HHV-8的阳性率较低,但并不除外HHV-8为新疆皮肤鳞状细胞癌的病因之一.
